关于木本植物组织培养的综述很多。到目前为止，使用过的种已达相当数量，但细胞全能性获得成功的种还有限。这是由于有关器官分化的情报资料不足引起的，为了掌握这方面的必威在线网站首页网址 ，这里，特就木本植物原生质体的分离和融合，愈伤组织培养的关键等进行阐述。

原生质体的分离和培养

1960年Cocking发表酶处理的方法以来，使用原生质体作为研究材料已较普遍。但只有在维持其生理生化活性的同时，完成原生质体相互融合，这种原生质体才是有意义的。

这种研究以木本植物为材者极少，主要因为木本植物健全的原生质体的分离极为困难。

1. 原生质体的分离

市售的酶，常常不是单一的，不仅作为其必要成分的果胶酶、纤维素酶等的含量比例不同，而且含有水解酶、RNA酶等不必要成分。因而，必须把叶片或培养愈伤组织预先于高渗溶液中放置数小时，然后用高渗的酶液处理，或者对市售酶进行脱盐或部分提纯。此外，在酶液中混加右旋糖苷硫酸钾以抑制RNA酶也是必要的。

从愈伤组织进行分离

从以木本植物为材料培养的愈伤组织进行分离是最近才开始的。Chalupa从云杉和黄杉培养的愈伤组织，Hricova等从云杉胚轴发生的愈伤组织，Winton等从黄杉的愈伤组织进行了分离。接着，Vardi等从柑桔胚珠发生的愈伤组织，Winter等从松及铁杉的幼嫩枝条发生的愈伤组织，分别进行了分离并获得了成功。

从叶肉细胞进行分离

谈谈叶肉细胞作为材料时，分离受阻的主要原因是什么？并涉及到其解决办法如何？

为了使取得健全原生质体的机率增高，在注意到叶龄及叶的生理状况的同时，更要注意选择植物的种类。这是因为细胞液泡液的渗透压因植物种类及年龄不同而异，这在分离原生质及维持其渗透压时影响很大。

因为木本植物叶的下表皮难以剥下，所以在酶处理时必须切断叶子。其结果引起切断部位的细胞被破坏，所以叶肉细胞本身所有的在分离时起有害作用的内生酶及有害成分也应予以考虑。首先，在细胞质中含有多酚类化合物，而且多酚氧化酶（存在于叶绿体、线粒体等小颗粒中）的活性高。因此，在抑制多酚类化合物氧化的同时，要想法把它从体系中除去，使之互不接触。为从体系中除去多酚类化合物，考虑使用Polyclar-AT吸附的方法，但无效果。为防止多酚类化合物氧化，使用SH保护剂—DTT是有效的。但是，如果它过多又会走向反面，起有害作用。此外，为节省分离所需时间，以果胶酶和纤维素酶同时进行处理是较有希望的办法。为除去萜类加入BSA有效。此外，盐或作为游离酸存在的草酸也存在于液泡中。草酸在生活细胞中无害，但一旦流出细胞外，与其它细胞接触则会引起细胞的明显变质。在木本植物中，它是否存在还不清楚，但应注意草酸是不受氧化酶影响的。

从木本植物叶肉细胞分离原生质体，于1975年为大山等以桑为材料首创成功。他们把叶细切为2平方毫米大小进行酶处理。接着，齐藤从泡桐和杨树苗的叶肉细胞用表1组成的酶液处理也分离成功。

从温室栽培的苗木的叶肉组织进行分离，一般说来是困难的。但齐藤以照度非常低的培养室（2700/lux，25°C，14小时光照）培育的泡桐树苗为材料，用表2所示之酶液也分离成功了。但要注意，在尽可能早期中断与酶液的接触是很重要的。

在无菌试管中培育的幼苗容易分离，估计这也适用于木本植物。

2. 原生质体的融合

关于融合的意义在一些文献中都已谈到。在木本植物的情况下，特别值得提出的是可能给予无固氮能力的植物体以固氮能力。

在把细胞融合利用于杂种细胞形成时，必须满足保坂所提出的各种条件。

从Carlson等发表资草（Nicotiana glauca和N. langsdorffii）的体细胞杂种育成以来，从各个方面对细胞融合的条件进行了研究。其中，Kameya的研究很出色。他把作为融合一方的原生质体用中性红染色。用此方法可以使从泡桐和杨的叶肉细胞分离的原生质体很好地着色。

在诱导融合时，多用Ca离子存在条件下的高pH值处理或Ca离子存在条件下的高浓度右旋糖苷硫酸钠或聚乙二醇处理。齐藤提出因为聚乙二醇可以高频诱起1对1的融合，因而适用于体细胞杂种的育成。他进一步观察了杨的种系之间和泡桐的个体之间的融合（图1的上下段），发现了泡桐和杨之间融合（图1的中段）的特异现象。在某个时刻，杨的原生质（液泡也如此）一瞬间内移到泡桐的原生质体中，但杨的细胞膜却决不会与泡桐的细胞膜结合而始终被残留着。这正是图1中段所显示的融合样式，核在杨的细胞膜内残留，而仅细胞质被泡桐所吸收是如何形成的呢？双核体的时期还未被断定，关于Power等的研究在Cocking的记载中谈到，脆质杂种（Cybrid）和近似的细胞系的诞生也十分可能，核的融合开始实现预示了体细胞杂种育成也是可能的。

3. 原生质体的培养

Vardi等把从柑桔的胚珠发生的愈伤组织分离的原生质体培养在缺乏生长调节剂的Murashige等的BM培养基中。这时，从照射X射线的细胞得到的愈伤组织得到的胚状体的再分化被促进，植物体的再生成为可能。进而，Button等从同样的柑桔的愈伤组织分离的原生质体再生出植物体取得了成功。

愈伤组织培养和花药培养

组织片或花药（花粉）培养得到的愈伤组织再分化出胚状体或小植物体，很重要。

1. 愈伤组织培养

愈伤组织的诱导及其继代培养

若在冬天取针叶树的组织片则愈伤组织生长不好，而春天取则生长很好。不过若使用极幼嫩的组织片则不受季节的影响。当然，不可能从同一植物体的任何部分取材都诱导出愈伤组织。苗龄不同也有影响，要尽可能使用幼嫩的侧枝、节间。Mehra等用扁桃，Barker用椴树并未观察到由于部位不同而引起的差异。此外桉树的木质茎发生的愈伤组织容易分化，这在某种意义上说是利用种的特异性取得的效果。当然所取组织片必须含有形成层，此外，组织片本身过小也会引起愈伤组织生长不良。

Durzan等发现若在恒温下培养云杉，其组织片的输导组织迅速出现。这个现象被White等用桧的试验证实了。

最重要的是培养基的组成，这里提一提各种培养基中的特别需要说明的情况。

在日本柳杉胚轴发生的愈伤组织的继代培养中，使用改变NH₄NO₃，NaH₂PO₄(2H₂O），KCI的量以改变N. P. K三要素比例的Wolter-Skoog（WS）培养基，进行90天培养，结果如图2。愈伤组织的增殖受N水平的支配。NH₄NO₃经常作为氮源，但在木本植物培养中，它的单独使用最好能够避开。

在针叶树中，松的培养是困难的。通常使用White，Heler，Gautberet，Mnrashige-Skoog（MS）或Brown-Lawrcnce（BL）的培养基作为基本培养基。但White，Hellor. Gautheret培养基中不含NH₄NO₃而MS和BL培养基中含量又太多。同时，在White培养基中P的量较少，而其它培养基中较多。因此，它们在成分上不一致。在松（Pinus clausa，P. rigida，P. serotina，P. elliottii，P. taeda）的培养中，Heller的培养基，在基拉地松（P. gerardiana）的培养中，White的培养基，在长叶松培养中，MS的培养基大概可以作为适用于不同种的培养基的典型例子。佐藤在最近的实验中，使用Steinhart-Standifer-Skoog培养基进行黑松愈伤组织的诱导和继代培养，认为是适宜的。

Mitchell等在研究松，槭树，云杉的发根和Zn的关系时，指出生长时期Zn的积累使发根能力下降并招致早期落叶。在用胚轴发生的日本柳杉的愈伤组织的培养中，使用缺少Zn的培养基不会发生褐变，因而在愈伤组织的培养中向培养基中加入多少Zn才是适宜的，也是一个值得研究的问题。

作为一个特殊的例子，在培养泡桐愈伤组织的培养基中不加F，则继代培养绝对不能进行。发根可以进行而不定胚的发生则告失败。

Steinhart等研究了对云杉进行培养时，各种有机成分的效果。结果是精氨酸、谷氨酰胺、尿素、肌醇、维生素B₁有效。Barnes在培养松时在Heller培养基中加入了抗坏血酸、维生素B₁、生物素，泛酸钙、氨酸，得到了良好的效果。Brown等在培养松时，在Ms培养基中加入天冬酰胺（天冬氨酸亦可）得到了良好结果。天冬酰胺提高了愈伤组织的生长速度。

天然抽提物质的利用有时也有效。麦芽提取液在松云杉愈伤组织培养中，椰子汁和蛋白水解产物在颠茄的培养中已被使用。但Hotson等报告了在刺柏的培养中椰子汁，酵母提取液无效。最近也有人报道椰子汁的显著效果。Fan等把泡桐的一年生苗及无菌的生长八周的苗的节、节间的组织片放在肌醇、维生素B₁，IAA，激动素、椰子汁、蔗糖和MS无机盐组成的培养基中培养，已成功地诱导出愈伤组织，并引起了器官分化。Skolmen等在用Schenk-Hildebrant培养基培养金合欢，诱导出愈伤组织之后，将其移入含椰子汁，2.4-D的MS培养基中继代培养，然后再移入缺少生长素而含椰子汁的MS培养基中培养，并进而移入含BAP的MS培养基中，成功地形成了小植物体。

在愈伤组织的诱导中必须加人生长调节剂，由于脱落酸在针叶树，阔叶树都被发现，这意味着在初代培养中不必要。最近BAP被有效的使用已见报道。生长素在一般情况下都是必要的。为研究这些生长调节剂的效果，用日本柳杉胚轴发生的愈伤组织进行简单的实验。把愈伤组织接种于生长调节剂量按三段加以改变的WS培养基中，以图3表示培养90天的结果。右侧图两者都是缺2.4-D而加入1 ppm GA，10 ppm IBA的。生长调节剂最少时愈伤组织生长良好。一般说，针叶树愈伤组织培养是较阔叶树容易的。

2. 器官再分化

在木本植物，只不过有少数属于阔叶树的种取得成功。如果组织培养的意义是应用于育种方面的话，那么，由木本植物特别是针叶树的愈伤组织诱发出小植物体的技术的建立，则是当务之急。

植物体的发生开始于Ball关于红杉的研究。他用IAA蔗糖，Knop的1/2培养基培养得到了茎叶体。Lawson等在无机盐溶液中含有烟酸，维生素B₁，维生素B₆，肌醇，天冬酰胺，BAP. NOAA，蔗糖的培养基中培养也取得了成功。Winton等将同样的从黄杉的胚轴发生的愈伤组织培养在BL的无机盐溶液中添加烟酸，维生素B₁，维生素B₆，肌醇，天冬酰胺，BAP，NOAA，蔗糖的培养基中也获成功。此外，在这些培养基中加入10 ppm IBA也使发根得到成功。这里特异的是NOAA的效果。在松、云杉上述实验也成功了。石川在柳杉的愈伤组织培养中发生了不定根。Kochba在同样的柳杉愈伤组织培养中，除了脱落酸外，由于蔗糖缺乏可引起生长迟缓，胚形成成功。

从柑桔的珠心发生的愈伤组织其胚状体，小植物体容易发生。另外，从胚珠或子房发生的愈伤组织分化容易。从柠檬桉的木质茎发生的愈伤组织小植物体容易形成，而从根尖或茎段发生的愈伤组织分化困难。麻疯树和檀香科植物（Leptomeria）的内胚乳发生的愈伤组织容易分化。这样看来，从什么部位取得组织片对于小植物能否分化是影响很大的。

用意大利改良种白杨的嫩枝发生的愈伤组织，在图2所示的那种NPK三要素分三段改变的MS培养基中培养60天时，得到图4的结果。在小植物的发生中，N水平也给予较大影响。

Skolmen等把从金合欢茎尖发生的愈伤组织培养在以MS培养基为基础培养基，再添加BAP，2.4-D，椰子汁的培养基中，使分化得到成功。金合欢因多酚类化合物多而常引起愈组织培养的困难，他的研究值得参考。

3. 花药（花粉）的培养

所谓花药培养对于木本植物诸特性的遗传方式的阐明是必要的手段。为得到单倍体植物进行了从花粉发生愈伤组织，再认愈伤组织诱导器官分化的尝试。

到目前为止，从花粉发生的愈伤组织成功地进行了器官再分化的种类已有一定数量，其中得到完整的单倍体植物的有五种，即全缘叶泽米、银杏、紫杉、兰伯氏松、多脂松。

单倍体的培养在针叶树较易做到。

结 语

如果单倍体细胞的培养乃至单倍体植物的培育由于组织培养方法的使用而在将来能自由地得到许多种类，那将在育种方面有很大实际应用价值。尤其在多年生木本植物的培育上可带来时间和劳力的极大节省。关于木本植物原生质体的研究及由细胞融合育成体细胞杂种的技术的开创，就是一个以此为目的的课题，愿不久的将来会有飞速的发展。

[译自［日]《组织培养》1978年4卷3期。何文竹 译]