大多数哺乳动物的卵子从卵巢里释放出来时正处于第二次减数分裂的中期阶段。卵子由滤泡细胞（卵丘）环绕着进入输卵管，受精即发生在输卵管近侧的壶腹区。当精子到达受精部位时发生了两种特殊变化（获能和顶体反应），使精子能够通过卵子的包围物（卵丘细胞和透明带）并穿入卵子。精子的进入标志着受精的开始，卵子放出第二极体，完成了减数分裂，雌性和雄性原核形成。哺乳动物含有父母本染色体单倍体的原核并不融合，但是当第一次卵裂时将开始时，核膜崩溃，来自两个原核的染色体汇集到有丝分裂的纺锤体上。当染色体恢复为成年哺乳动物特有的双倍体时，受精也就完成了。受精卵，现在更常称为胚胎，在通过输卵管时继续分裂并进入子宫，以大多数哺乳动物来说，此时为受精后的3~8天，处于4个细胞和早期胚泡之间的发育阶段。植入依物种而定发生在一天或几周之后。

为了从多方面详细研究受精和植入前的早期胚胎发育，必须设计一些技术，以便能在雌性生殖道外对配子和胚胎进行操作和培养。尽管以前曾多次尝试使哺乳动物的卵子在体外受精并进行培养，但这种技术在近15 ~ 20年里才成为切实可行的。早在1890年（Heape：《家兔胚胎的移植》）和1907年（Harrisons：《神经细胞的培养》）就报道了胚胎移植与细胞体外培养的首次试验，为什么进展都如此缓慢？首先，哺乳动物的卵子比较小（除去透明带，直径为60~180μm），而且即使是多卵子的动物，如猪、小鼠和家兔，每次排卵也只释出数目有限的几个卵子。因此，发育生物学家倾向于研究卵子比较易于得到的卵生类动物，如棘皮动物和两栖类。其次，因为这些低等动物的受精和早期发育在很大程度上与直接的外环境无关，故而对哺乳动物发育的这方面情况未予重视。第三，在体外模拟母体的环境已证明是个不易解决的难题，特别对各种哺乳动物来说，为体外受精和植入前发育所需的条件看来是不一样的。就是在今天，也只有少数几种动物的卵子能成功地在体外受精、培养并在移植到养母体内后能继续发育到出生。尽管如此，我们对受精机制和早期胚胎发育的了解有所深入主要还是由于改进了体外培养系统。笔者将讨论在体外受精、胚胎的移植和储藏技术中的一些原理，不打算泛泛地综述文献。

体外受精

自从Chang（1959）报道首次成功地使家兔卵子在体外受精以来，已有十多种哺乳动物的卵在体外受精的报道。但体外受精仅在家兔、小鼠和大鼠里是确实成功的，且在移植到养母体内后生下了活的雌雄后代。可是，最近人类的体外受精首次获得了成功，把体外受精发育成的胚胎移植回母亲体内，这位母亲的输卵管因阻塞早已被切除，后来生下了一个女婴。

体外受精取得成功的主要先决条件是选择合适的培养基，不仅要能保持精卵的活力，而且要提供必要的环境使受精的一系列正常过程得以进行。

精子的制备

精子于雌性生殖道内发生了两项准备性变化，精子获能问题在发展体外受精技术方面最受重视。自从Austin（1951）和Chang（1951）首次在家兔里发现这种变化以来，关于这个题目已有了大量的文献报道，但对获能的确切机制尚未完全了解。使精子获能的体内条件并没有严格的物种特异性，甚至也无严格的器官特异性，但获能需要的时间却因物种而异。例如，家兔长达六小时，小鼠则不到一小时。这种时间上的差异可能反映了不同哺乳动物的精子质膜在化学组成上有差别。由体内和体外研究得到的证据表明，精子的获能过程包括去除包裹在精子表面的附睾和精液蛋白，使精子能发生顶体反应，最后能与卵膜融合。有些覆盖物具有高度免疫原性，已证明至少有一种能抑制受精。它们牢固地附着在精子膜上，单靠生理盐水是洗不掉的，但用高渗溶液可以去除这些覆盖物，于是精子获能。

最初的体外受精试验需用事先在子宫里获能的精子。如今，把小鼠、大鼠、豚鼠和人的附睾里的精子或射出的精子预先放在化学成分较为简单、根据Tyrode's或Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液配制的培养基里温育，就能有效地使精子获能，毋需加入雌性生殖道的液体。即使如此，获能的特殊要求还是难以捉摸，可能因为现在对这个过程的终点还不明确。

精子的最后一项预备性变化即是顶体反应，这在形态学上是很明显的，包括顶体外膜与覆盖其上的精子质膜间的多处融合。一般认为这发生在精子通过卵丘细胞、但还未穿入透明带之前，但在体外没有卵子和周围的卵丘细胞时也能发生顶体反应。透明质酸酶是在顶体反应之前或在反应过程中从顶体里释放出来的，在正常情况下协助精子穿过卵丘细胞的细胞外基质。但在体外，受精培养基中的精子密度必须相当高，以产生足够的透明质酸酶，这样，在把精卵放在一起的几分钟里就可把大部分卵丘细胞除去。顶体反应产生的主要结果有三个。首先，暴露出来的顶体内膜含有特别的识别位点，使精子能与透明带结合。这g位点具有物种特异性，这也许就是异源精子不能穿过透明带的原因。其次，结合在顶体内膜上的一种溶酶，称为精虫头粒蛋白的（性质与胰蛋白酶相似），协助精子穿过透明带。第三，只有发生了顶体反应的精子才能同卵膜融合。这个过程显然不具物种特异性，因为几种亲缘关系很远的动物，如小鼠、豚鼠、人类和猪的精子在发生了顶体反应后，于体外都能穿进去除了透明带的仓鼠卵。

通过体外研究确定了顶体反应需要的几个条件，虽然在很多情况下要分开精子获能和顶体反应需要的条件是困难的。在培养基里有葡萄糖时，顶体反应似乎受阻；而在有乳酸和丙酮酸时加速。血清白蛋白和Ca⁺⁺是培养基的主要成分。虽然能使顶体反应发生的pH和渗透度范围很宽，但还未确定对受精和进一步发育最为适合的范围。

体外受精不同于体内受精，它所需要的精子浓度非常高，从每毫升10³个到10⁷个，但用于大多数动物的浓度一般是每毫升10⁶个左右。高浓度会增加异常精子受精可能性的想法还未得到证实，但较高浓度的精子（每毫升10⁶~10⁷个）可以提高小鼠多精入卵的发生率。这在其它动物里也已得到证明。

卵子的制备

卵子自卵巢滤泡中取出后，在体外经过了从生发泡到第二次减数分裂中期的成熟过程，但迄今为止并未证明这种来源的卵子适合选来进行体外受精。虽然受精能够发生，但进一步的胚胎发育却受到了限制，小鼠在体外成熟的卵只发育成少数胚胎。在体内和在体外成熟的卵细胞于蛋白质成分上似乎有相当大的差异，这可能反映了现今供成熟用的培养基还有问题。另一项已成功地应用于人类的研究是在排卵前几小时才把卵子从滤泡里取出来，此时的卵子差不多已完全成熟。

从经过促性腺激素处理的妇女可以得到较多的卵子。这种一般称之为“排卵过速”的处理主要包括注射促卵泡激素（FSH）以增多卵巢内成熟的滤泡。及注射促黄体生成素（LH）以启动卵细胞的成熟且诱导卵子从成熟的滤泡中排出。注射程序，从注射LH到排卵之间的时间间隔均因物种而异。有些报道指出，促性腺激素的&理可能会提高染色体异常的胚胎的发生率，跟其它研究者不同，Maudlin和Fraser未能在体内发现这种效应，只是在小鼠受到大剂量FSH的作用而过速排出的卵于体外受精后才发觉有这情况。他们认为，至少在体外，过速排出的卵子阻止多精入卵的机制是有缺陷的；可是，Takagi和Sasaki（1976）的研究指出，这是在卵细胞减数分裂成熟过程中的一个缺陷，因为没有排出第二极体。显然，这问题需要进一步的研究。

用注射LH的方法抉择排卵的时间在体外受精技术中起重要作用，因为卵子排出后只在较短的一段时间内是可受精的（大多数哺乳动物不超过10~12小时）。通常是在排卵完成后的几小时内从输卵管里取出卵子，并立即和获能的精子放在一起培养。再迟一些，取出的卵子会发生自发性的病理变化，就不能受精了。

在体外使用发生过获能和顶体反应的精子时，这些卵丘细胞对受精似不起作用，因为小鼠卵周围无论有无卵丘细胞都是一样地受精。

人类的体外受精

因为近来对这个问题很感兴趣，故此简叙一下所用的方法。Steptoe和Edward（1978）所用技术的基本方法和主要特点类似于对其它哺乳动物体外受精所作的描述。

（1）在注射人体绒毛膜促性腺激素（HCG）32小时后，也即排卵前的4~6小时，用腹腔镜从卵泡里吸出即将排出的卵子。经人体泡径促性腺素（HMG）或ClomipHene诱发卵泡生长可增加即将排出的卵子数目。但在仅用HCG处理以诱发卵子成熟而未经刺激的周期里，只能收集到1~2个即将排出的卵子。

（2）刚刚排出的精液液化后，经低速离心，用适当的培养液洗涤几次以除去精液原生质。最后浓度为每毫升10⁶个的精液经过至少1?小时的培养以启动获能过程，然后加入刚采集的排卵前卵子。

（3）精子可以在三种培养基中完成获能和受精：或用改良的Tyrode's培养基，其内添加了葡萄糖、丙酮酸和牛血清白蛋白；或用为培养小鼠胚胎而设计的改良Kreb's-Ringer碳酸氢盐培养基，其中添加了人血清；或用热灭活的人血清。这些培养基的pH为7.5 ~ 7.6，在37°C培养时保存在成分为5%CO₂，5%O₂，90%N₂的气体或含5%CO₂的空气中；渗透度为285~295毫渗透分子。

（4）授精后12~15小时，将有原核的卵子移到添加了胎牛血清、牛血清白蛋白或灭活人血清的-F_-10培养基中使之进一步发育。

胚胎移植

如今认为，对大多数实验室动物和家畜来说，胚胎移植既是一种有价值的实用手段，又是一种有价值的试验手段。胚胎移植可应用于下列研究：①在体外经受精、培养和贮藏等各种操作后使胚胎继续存活；②母体与胚胎的相互作用，即移植、生殖年龄和发生的控制；③提高遗传性优良的雌体的繁殖力，亦即改良家畜；④控制疾病的传递，即产生特殊的无病原动物；⑤治疗某些类型的不育妇女，如患输卵管阻塞者。胚胎只有在植入前的发育阶段才能取出并进行移植。这方法的主要步骤为：从供者收集胚胎，在体外贮藏胚胎以及将胚胎移植到合适的妇女受体体内。

胚胎的采集

前面已提到，经适当的激素处理可以得到较多的卵子，就大多数物种来说，经过交配，这些卵子一般都可受精。但对绵羊作的这种过速排卵的处理似乎干扰了精子通过宫颈，因此经常不能查精。这个问题可以用在局部麻醉下把精子直接放到子宫里去的方法解决。由雌体过速排卵和正常排卵得到的胚胎具有相同的发育能力，虽然已有报道，过速排卵的胚胎在植入前染色体异常的发生率较高，但没有证据表明由过速排卵的胚胎长成的子代中有异常增多的现象。另有文章详述从不同动物采集胚胎的方法。简言之，处于植入前不同发育阶段的胚胎是在交配后的一定时间里，从雌体生殖道的适当部位冲洗出来的。对于实验室的小啮齿动物，通常是杀掉以收集胚胎；而对比较大的动物，如家兔、灵长类和家畜r则是在全身麻醉下剖腹采集胚胎。但常常由于手术干扰产生粘连，限制了从同一雌体重复采集。用经宫颈冲洗子宫的非手术方法可取得较晚期的胚胎（桑椹胚和胚泡），这种方法很有希望用于牛和马，其它牲畜因宫颈不直而不能使用。

采集所用培养基

在供体和受体之间转移胚胎对培养基的主要要求是在采集和体外操作期间保持胚胎的生活力。许多种培养基，从全血清、复合组织培养基如TCM199、F_-10，到添加了血清或血清白蛋白的简单的平衡盐溶液，都已用于大多数动物的胚胎采集。其效果是难以比较的，因为在植入前于体外放置的时间、pH和温度的波动、受体动物的准备等方面变化都相当大。由最近对实验室动物和家畜所作的研究结果来看，最合适的培养液是简单的生理盐水加碱酸缓冲液或Hepes缓冲液，再补以葡萄糖、牛血清白蛋白或牛血清以及抗生素。这类培养基的pH在空气中保持稳定（7.2~7.4），比以前用于大多数胚胎移植的碳酸氢盐缓冲液要好，因后者的pH在空气中不能保持稳定。在移植过程中接触高pH（7.8）对处于分裂早期的仓鼠胚胎有不良影响。温度变化大而快也可能不利于胚胎的存活。据笔者的经验，小鼠和仓鼠的胚胎从采集到移植都在恒定的室温下，其成活情况比从37°C的培养箱里拿进拿出的胚胎要好得多，至少对不到3小时的放置来说是如此。

碱酸缓冲培养基和Hepes缓冲培养基适于低温贮藏，而且当胚胎于37°C培养时也能维持卵裂后期阶段的胚胎（8个细胞和桑椹胚）发育，至少能发生一次或两次卵裂。牛胚胎先在加有胎牛血清的碱酸缓冲培养基中培养48小时，之后进行移植，成活率较好（50%）。这些培养基都不能维持任何一种已研究过的动物胚胎通过整个植入前阶段的发育（从1个细胞到胚泡），甚至在正常用于胚胎培养的碳酸氢盐缓冲培养基中，也只有家兔和小鼠能完成植入前的发育。而且，除小鼠外，若植入后的胚胎在体外培养超过了48小时，其成活率就会急剧下降。这反映了我们对植入前胚胎发育的必需条件还缺乏了解。

几年来，用家畜和实验室动物做了大量的胚胎移植，但迄今还无证据能说明移植前对胚胎的简单操作会引起后代的异常。植入前的胚胎与在器官发生时的植入后胚胎相比，对畸胎生成有明显的抗性，任何不利的影响或是引起胚胎死亡，或是胚胎得到恢复，如果有足够的存活细胞，则进行正常的发育，可是近来有迹象表明，某些药物在植入前使用有致畸胎效应；与体外移植的正常操作相比，这些是起主要作用的因素。

移植入受体

另有文章详细描述胚胎移植的程序。大多数胚胎是通过外科手术、经剖腹移入输卵管和子宫的，但不作外科手术而经宫颈转移牛、小鼠和人的胚胎也已获得了成功。正像不用外科手术采集胚胎那样，只有在宫颈管容易插管时才有可能通过宫颈移入胚胎。一些动物，在其动情周期（家畜）或月经周期（高等灵长类）的排卵后期中，黄体是有功能的。对这些动物来说，交配刺激对建立妊娠并非必需，因为移入的胚胎必将延长黄体的功能期。对那些动情周期无黄体期的动物，如大鼠和小鼠，要激活排卵后的黄体，往往用不育的雄鼠同受体交配或用机械刺激宫颈的方法。建立假妊状态。给处于发情期的雌兔注射LH可得到受体，LH诱发排卵并诱发有活性的黄体形成而无需交配。使多组受体的发情期同步化，以便在任何特定时间里都能得到足够数量的复体以进行胚胎移植，这在实践上是有好处的。已证明前列腺素和黄体酮对绵羊和牛有效，但是当用小剂量促性腺激素使小鼠同步化时，受孕率却下降到61%（受体自然交配的受孕率为91%）。

胚胎在移植后是否能成功地进行发育取决于供体和受体之间在交配或动情周期方面的同步化程度。这随物种、生殖道内胚胎的着床位置（输卵管或子宫）以及胚胎的发育阶段而有所不同。从输卵管里取出的发育早期（1~8个细胞）的胚胎，通常放到与供体的交配和发情时相都相同的受体的输卵管内（同步移植）。在小鼠里，当受体处于妊娠或假妊娠的第一天时，也即能找到阴道栓的那天，植入前的各个发育阶段都能成功地转移到其输卵管内，但这种移植方法还没试用于其它动物。当移入受体子宫时，处于早期卵裂（到8个细胞为止）状态的胚胎继续发育的能力有很大的物种差异性。虽然这与胚胎进入子宫时的发育阶段有关，但也反映了不同物种的子宫环境对早期卵裂的维持能力不相同。在大鼠和小鼠里，1个和2个细胞的胚胎在移入子宫的24小时内退化，尽管供体和受体是同步的。虽然2个细胞的猪胚和2~8个细胞的绵羊胚胎在移入子宫后可以存活到出生，但若移到输卵管里，成活率则明显提高。最近证明，1~8个细胞阶段的猕猴胚胎移植到同一雌体的对侧输卵管里或子宫对侧后能继续发育到出生。由体外受精而得到的8个细胞人胚胎，在移植入子宫后也发育到出生。

子宫移植可以允许一定程度的非同步化。有些动物的胚胎在进入子宫后过了些时候才植入，在这些动物里非同步允许程度的变异最大，例如牛和绵羊，受体和供体可以有1~2天的不同步。大鼠和小鼠的胚胎进入子宫后不久就植入了，用同步受体或只比供体迟一天交配的非同步受体都能移植成功。如果在体外操作时胚胎发育被推迟，这后一种非同步化类型有其方便之处。就高等灵长类和人类来说，植入和子宫接受胚胎附着的精确时间都还未得到明确，因此必须肯定供体和受体间的非同步究竟能允许到何种程度。

胚胎的贮藏

低温贮藏哺乳动物胚胎首次取得成功是在1912年报道的。此后，其它几种动物，如牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠的冰冻胚胎在解冻后移入养母体内发育成了活的幼畜。了解其它细胞类型暴露于零下温度时的行为在胚胎保存技术的发展中有很重要的作用。如细胞大小，细胞通透性，冷却与融化的速率，冷却保护剂以及最后贮藏温度的选择等因素，在设计特定类型细胞的存活条件时，都必须加以考虑。关于胚胎贮藏的详细讨论，读者可以参阅最近Ciba基金会的讨论会和另一些综述。在此，笔者着重谈胚胎贮藏的基本特点及其在生物医学研究中的应用。

冰冻和融化

原已证明，用甘油和二甲基甲砜（DMSO）作冷冻保护剂时，非常缓慢的冷却（0.2~0.8°C/分钟）和融化（4~25°C/分钟）是植入前各阶段的小鼠胚胎能够成活的关键。这是目前保藏动物细胞的最慢的冷却和加温速度，因此冷却生物学家对此特别感兴趣。这些慢速度最适于胚胎存活，其温度临界范围是：冷却时为-40°C到-60°C；再加温时为-70°C到-20°C。在缓慢冷却过程中，由于培养基中的水冰冻，故而溶质磁度增大，造成细胞皱缩。甘油和DMSO可保护细胞免受高浓度溶质的损伤，同时也降低了细胞内出现冰冻的温度而有助于脱水过程。当胚胎冷却速度低于1°C/分钟时，即使温度低到-135°C，细胞内也不会有冰出现；但如果冷却速度超过了5°C/分钟，则在-40°C到-50°C之间就会出现细胞内冰冻。细胞内结冰的损伤作用是由于解冻时冰晶生长或重结晶，或因冰晶融化时给细胞加以渗透张力而产生的。某些细胞类型如红细胞，用速融法可以在一定程度上消除这些不良影响，但直到最近还是认为速融对哺乳动物的胚胎有致死作用。可是，只要缓慢冷却到-30°C到-50°C时立即转移到-193°C的液氮里面，有几种动物（牛和绵羊）的胚胎经过速融还是能存活的。这些试验说明，只要融化迅速，即使细胞内有一点冰晶也还能存活。这使得实践中的操作技术不致过于繁复而且又节约了时间。很难解释为什么速融能使缓慢冷却的胚胎死亡，因细胞内并没有冰晶存在，除非在胚胎内的亚细胞结构重新装配必须再行水合。

最适于胚胎贮藏的培养基是含有牛血清白蛋白的碱酸缓冲液或Hepes缓冲生理盐溶液。在所有迄今已研究过的动物里使用的冰冻胚胎技术基本相同。可是，胚胎对冷却到0°C的敏感性却有物种差异。猪胚在15°C以下就不能存活；晚期桑椹胚阶段（大约32个细胞）前的绵羊胚胎和胚泡阶段（64到128个细胞）前的牛胚胎，若冷却到0°C，便都会遭到损害，但这两种动物处于这些或更晚发育阶段的胚胎可以成功地保存下来。所有这三种动物的胚胎都含有高浓度的脂质，这也许就是胚胎对冷却过程敏感的缘故，因为细胞膜脂质受温度诱发的相变可能会破坏细胞的完整性。

贮藏的期限

理论上，如果胚胎能耐受不再有任何生物化学活性的低温，那么就可以无限期地把胚胎保存在一个生机暂停的阶段上。-196°C的液氮符合这个要求，因为在这个温度唯有光物理学反应能够发生，如电离辐射。这类辐射引起基因损伤，而且在-196°C时这些损伤积累了起来，因为正常的酶修复机制也不起作用了。在正常的生理学温度下，自发突变中自然发生的或由本底辐射引起的不到1%。因为本底辐射可能是贮藏过程中引起突变的仅有因素，所以即使在-196°C时修复已被阻止，遗传的变化仍应大大低于自发突变率。本底辐射的自然水平是这样低（0.5~10rad/年），以致大约得要200~1000年的贮藏时间才能使存活者明显减少。DMSO，玻璃安瓿以及低温本身在贮藏过程中都对本底辐射起防止作用。迄今为止，在那些于-196°C中保存了2年，经受了相当于200年本底辐射的小鼠胚胎里，还未发现有额外的胚胎死亡或基因变化数目有所增加，因此，对于在-196°C中长期贮藏哺乳动物的胚胎，似乎没有明显的障碍。

贮藏的应用

贮藏胚胎而不贮藏精子或卵子的主要优点在于胚胎包含了将长成的个体的全套基因组或染色体份额，这样就可以把胚胎移植到遗传背景已知或未知的养母体内而没有遗传变化的危险。小鼠是哺乳动物遗传学的主要研究模型，在小鼠里已发现几百种突变基因和多形性，新的还继续在诱变研究，如辐射研究中产生出来。其中有许多为人类和动物的疾病及缺陷提供了模型，如肌萎缩，无胸腺小鼠和抗雄性素（Tfm）小鼠。这些基因只有一小部分是随便哪个实验室都能保存的。因此，胚胎贮藏库将使各实验室都能有许多原种，都能保存那些不立即使用的原种以节约地方和成本，并防止因失火、疾病或其它危险造成损失。某些罕见的突变可能永不会再发现，所以将它们贮藏起来是极其重要的。所谓小鼠同种原种是经多代回交产生的，在免疫遗传中有不可估量的重要性，胚胎库将保护它们以免丢失。小鼠胚胎的贮藏可以用来计算基因漂移量，将第一次能在经过几代的哺乳动物自交系里进行计算。把一个世代的动物以胚胎的形式贮藏起来，在融化后就可以同以后世代的后裔作比较。国家和国际的胚胎冰冻库将有助于使小鼠纯系标准化并对于使用贮藏组织培养细胞的方法保存突变和特殊品系有所裨益。

农业上，冰冻胚胎将有利于向其它国家出口良种和新品种。此外，把胚胎移入本地品种的养母体内可以使新生动物对地方疾病具有一定程度的早期抗病力。胚胎贮藏能用来估计经过一段时间后，在家畜改良方案中得到的遗传上的收益。贮藏比较少见和罕见的牛和绵羊品系的胚胎，有助于保留这些否则可能丢失的品系。这样的基因原料在将来可能对家畜的改良起重要作用。

在人类医学方面，胚胎贮藏可能是治疗某些类型妇女不育症的辅助手段，特别是治疗那些输卵管发生梗阻的妇女。为增加卵巢里成熟卵子的数目并确定卵子里最后的成熟变化发生的时间以便进行采集，使用了促性腺激素治疗，结果引起类固醇激素浓度大大升高。因此，如果能贮藏体外受精的胚胎并在正常的月经周期恢复时送回母亲的子宫里，那么植入和正常受孕的机会就会明显增加。即使卵子是从正常未受刺激的周期里采集来的，在体外培养过程中可能发生胚胎发育迟滞，这会对子宫与再植入的胚胎在着床时间上的同步化产生不利影响；在下一个月经周期再移入胚胎可以消除这不良影响。最后，如果在一个刺激周期里采集到了二个或更多个卵子，经体外受精后贮藏起来以备相继进行移植，那采集一次卵子就能受孕多次。

[British Medical Balletin 1979年，35卷2期]