完整植物和外植体

一粒种子离开母体后随着信息重新建成具有与母体类似的形态、结构和功能的一个完整植物。信息在胚里如何保持和如何表达，还了解得不很清楚。我们所知道的是由一个相当简单的受精卵，通过连续的有丝分裂，而且最先是不均等分裂，然后形成一个复杂而成熟的多细胞有机体。我们现在面对着一个具有功能特化、结构协调有一定模式的细胞、组织和器官的集合体，它们具有活着的有机体所特有的特征：它们的各个细胞，通过有内在联系的网络系统，在时间和空间上是固定的，这个网络系统，由各个基本粒子、分子、原子和大分子联结在一起，组成复杂的有机体。这个整体的任何部分发生变化，导致组成部分的不同排列以及在这个内在相互联系的网络系统中出现新的情况。

在网络系统的空间和时间上可以变动和改变的前提下，我们如不考虑在外植体和母株剩余部分中目前所发现新的有内在联系的网绛系统，就不会去从母株上切取一些部分，并把它们放在培养基中去。在外植体被切取之后，被它带入培养基的“固有的细胞状态”和所谓“母体过去的状态”，都像其他重要因素，如营养物质、植物激素和环境条件一样作用于外植体。所谓“固有的细胞状态”在烟草和兰猪耳草茎切段或沿着茎轴和花枝撕下来的薄细胞层上已清楚地显示出来。我们能够通过母株预处理和变更其生理的、生物化学的和遗传的特性来调节“细胞的固有状态”。

试管植物形态发生的现状

根据植物在试管培养中形成新的形态、结构和功能的不同能力：可以把植物分为两个范畴：容易再生的种类和难以再生的种类。它们之间不同在哪里呢？尝试回答这个问题之前，让我们略述一下试管里形态发生的现状。

（一）生长素与细胞分裂素的比率及其他因素

由于植物激素的发现和生长素/细胞分裂素比率的调节假说，导致农业和工业上应用的重大进展，并促使单倍体培育及原生质体融合成为有W途的技术应用于基因工程。我们确实已经被植物的细胞所呈现的全能性及通过改变生长激素的比率，在一些植物种能再生出一些器官的情况着了迷，我们从1957年就几乎已经确信，生长素与细胞分裂素的比率是控制形态发生的根本。事实上，当我们遇到一些不容易得到成功的情况，我们熊设法克服这些困难。（a）、采取改变生长素和生长初制物的种类，例如Pichloram或三碘苯甲酸（TIBA）代替2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），用赤霉素（GA）和6 - 苄基嘌呤（BA）代替萘乙酸（NAA）和6 - 苄基嘌呤（BA），或用生长素配合去代替单一的或无生长素；（b）、采取从培养基中除去或琼脂。而改变大量、微量营养物质的比率及各种诸如碳或有机化合物（维生素、氨基酸、多肽类、苯肢酸、多肽、甾醇或各种植物的提取物）的附加物质，也能影响形态发生。有些物质，如酪氨酸、多肽物质（1，14）或苯胺干扰细胞分裂和苗的形成。另外像碳水化合物，葡萄糖或蔗糖控制烟草的薄层细胞上形成管胞或重新发生花。在这方面还可以加上光（质和量）、pH（9c）、水势（39b）、温度、大气、容器的形状等等的变动和大量的不同组合试验。但是，至今既没有得到有关各种因素的突破又没有得出有关生长素和细胞分裂素比例的独特的假说，在以细胞为对象分散在多相的细胞群之间时，能对其形态发生的分化全过程带来一个比较接近的基本了解。从这方面考虑，要求对所有的形态发生类型，需要一个共同的细胞起源，以便更加接近于作为目标的细胞和形态发生信号的作用。

（二）全能性，偏能性或无全能性，薄层细胞的多种潜能

是否能从相同的实验系统，在试管培养里获得形态发生的所有模式，仍然是一个需要开展讨论的问题。最经常地得到的模式是愈伤组织、管胞接着能发生芽和根的结节。花或胚在这些系统中是不能获得的。只有一种模式即从母体植物分离出来的大孢子或小孢子能获得胚的形态发生（是经过愈伤组织或不经过愈伤组织形成）。虽然，胚能认为是全能性，大孢子和小孢子似乎相当于偏能性。就几个能得到再生花芽的实验系统而论，只有二个选择对象：花芽或营养芽，而胚和根都没有得到。在一些种类中，气孔的保卫细胞被认为是无全能性。因此，通常不是所有的形态发生类型（胚、根、芽、花）能从同一的材料上得到，即从同一细胞层或从相同的细胞而言。全能性或许可能存在，但至今只有一个或二个器官发生的潜能出现。

使用一个细胞层系统的目的是促使同一细胞层产生所有形态发生的类型，但在一定时间内仅有一种类型完整形态发生的程序。实验已显示秋海棠叶表皮单层细胞能按程序“重新形成”单细胞毛（假使我们从组织起源考虑，这是一个新的形态发生类型）、根或芽，但是没有花或胚的形成。烟草的薄细胞层形成新的芽、根或花，同样从同一层细胞，如果变动葡萄糖、吲哚丁酸（IBA）和激动素组合中的量，会形成愈伤组织，而无随之而来的任何器官发生。

（三）切割、创伤和愈合

只要组织或细胞是在一个完整植株内，有内在联系的网络系统中在个体发育分化时期所形成的，这些组织或细胞的行为类似成熟的细胞，这些细胞和组织在形态发生程序的表达上是受到限制的。在某些情况下，这些组织或细胞的分离，在无任何外因的影响下，足以启动再生芽、根或愈伤组织的形成。因此，考虑到作为常规操作的错综复杂的后果是重要的。什么是被切割本身所启动的内容以及哪个是主要的形态发生的过程？为了要回答这二个问题，要设计这方面的实验是困难的。因为在试管系统里形态发生的分化，总是出现在强迫切割措施以后。未经切割而再生形成芽的情况，仅知道在未受伤的海棠的叶片和附加6（γ，γ- 二甲丙烯氨基）嘌呤（DMAAP）处理而得到的结果。切成薄片激发重要的代谢和遗传变化而导致活跃的有丝分裂，这在马铃薯块茎的休眠组织。上显示出来。一些研究者非常注意细胞分裂前的许多变化：细胞器和细胞核的移动，细胞核增大，内质网范围扩大，多体（指染色球）的形成和筛板胼胝质塞子封闭。此外，其他结果在切割后很早就被发现的有：膜的透性增加，离子键断裂的变化，DNA随体的合成，生长素的合成与破坏，随之而来的是不同基因的活化，过氧化物酶活性的增加，蛋白质和萃酚化合物活跃的合成以及呼吸作用和乙烯产生的显著增强。这些复杂的变化发生在培养的始期，因而强烈地改变“细胞的固有状态”。

然而，单纯的切割不能充分地启动烟草的髓组织和烟草薄细胞层的细胞分裂。对于难对付的种类，特别重要的是仔细地研究切割之后代谢和遗传方面的变化：DNA增加，过氧化物酶活性变化，同功酶谱的变化以及酶化合物代谢的变化。这些化合物中的某些物质，认为可以作为生长素的保护剂，可以阻碍吲哚乙酸（IAA）的破坏，同样作用于细胞膜的极化和抑制离子的吸收。明确了解创伤的作用以及测定内源生长素含量，酶的变化和DNA的变化，将有助于决定是否需要供给外源生长素，如果这样的话，问题在什么时候供给，以何种比率。事实上，有些情况下，芽的诱发是在生长素较高于激动素的水平，而根的形成其比率则相反。此外，在木本植物、兰科植物和一些豆科植物遇到的一个困难是诸如黑色素之类的多酚化合物及氧化产物的沉积，那也可能是木质素、软木脂、角质的增加和胼胝质围着切口的表面，它们可能对培养基的组成和代谢物的吸收有很大的改变。

（四），在试管培养中产生的变化

1. 遗传的和后生的变异性：除了有形态发生的潜力和缺乏形态发生的能力二者在延长周期，中能维持的情况之外，有一些情况，可以逐渐地观察到在愈伤组织培养中形态发生能力的消失。在细胞培养期间，对遗传的和后生的变化曾做过记录，重要的遗传变化发生在切割和试管培养期间：染色体的核内复制，细胞核断裂形成多核的细胞，以及正常的积不正常的有丝分裂。这些变化造成异质细胞的群体易有从二倍体到非整倍体或多倍体的倍性水平。可以设想从多次的愈伤组织悬浮继代培养中可以选出二倍体细胞。根据具有混合倍性水平的愈伤组织上仅二倍体植物能得到再生的观察，有一种假说认为只有二倍体细胞是有形态发生能力的，这不可能是个普遍的情况。因为单倍体和亚单倍体（在试管里从花粉粒形成的单倍体细胞层获得胚胎发生的结果）表皮和表皮下的薄细胞层，显示出高的形态发生的能力。在黑暗条件下，45%二倍伴细胞层形成营养芽和花芽，单倍体细胞层则为80%。

然而，形态发生的能力的变化，未必总是由于遗传性的改变，下面的因素是与后生的变化有关系：植物激素的水平和多肽的变化，显示出对适应和不适应的细胞品系；表现型的变异，通过母系的传递，在几个世代中保持稳定。另一方面，当活体内单倍体母植物（N=X+X'=24）与在试管内薄细胞层形成花，其花粉母细胞以分裂中期Ⅰ染色体的配对频率相比较时，在烟草中观察到细胞质和基因组的相互作用。一个令人瞩目的发现是：当从试管内取得的小孢子进行培养时，由于染色体行为不同的结果，获得了胚的形成。这些胚和随之形成的植株，发现都是非整倍性和亚单倍体，其染色体数目范围是2~24个。一些亚单倍体的烟草植物，失去了它们开花的能力而保持营养状态。

在单倍体植物活体内，出现不正常的减数分裂，造成败育的花粉粒。目前因试管里的减数分裂而使亚单倍体的形成成为可能，且已扩大到另一个烟草种（2n=2x=20）。在试管内培养的花药，已显示出比在活体内的花药较容易有胚胎发生。这一发现将使利用价值较低的一些种有可能产生单倍体植物。因为在试管内花的形成决定于基因型，所以有二个选择对象，二者抉择其一：一个是与有利的基因型杂交，另一个是在试管内适宜的培养基上诱发花原基。

总之，试管里培养，提供不同的相互联系的网络结构，开发新的遗传和后生的特性。这是一个重要的基础和应当研究的领域，值得推广于带有一定的细胞核和细胞质标记的系统上去，（例如细胞质的雄性不育）。

2. 试管培养系统内的光合作用 - 呼吸作用和光呼吸：绿色器官或组织对于光和外源的二氧化碳的需要；在试管培养系统和活体系统中，有本质上的区别。使用萘乙酸（WAA）二氧化碳含量丰富的空气以及强光照的适当配合，可以从混合营养培养中选择一个自养的细胞系。这一成功是非常重要的。虽然在某些情况下，不起光合作用的体系（在没有外源抑制物的干扰下），在作为光受体的叶绿体与细胞核协调作用下，对测定其所进行的形态发生的过程部分是有用的。

3. 器官和组织特性的决定因素：由试管内培养的技术所带来的其他变化，它与基因表达的调节有关。例如在烟草的原生质体中，蛋白质分段；的生物合成几乎完全停止。

令人瞩目的许多问题之一，植物细胞是否产生一些对分化的某-一步骤起特定作用的蛋白质。免疫扩散和免疫电泳的方法已经揭示，从不同器官诱导而来的愈伤组织细胞比起作为它们起源的器官，出现一个较宽的决定因素的范围。这些包含了特定的和一般的决定因素。此外，对烟草中主要发育阶段的特定的蛋白质，体细胞和雄核发育的胚胎发生时所出现的贮藏蛋白质的合成，对维管组织分化有关的一些特定蛋白质的出现，以及在分化期间；外原凝集素量的变动，也已经报导过。这些标志着，假如能在细胞或组织内正确地定位，对尽可能地去完善环境因素和培养基的组成是有很大的价值。这样，对一定的分化模式，不适宜的任意的条件就可能避免。此外，诸如各种次生产物的出现等其他的变化，可能在一些情况下，或者同细胞分裂的某种类型相关，或者和形态发生的某一阶段相互关联。

控制形态发生的尝试

形态发生的二个水平的控制，能引用于母株的水平上去尝试调节接种体的“固有的细胞状态”以及在接种体本身的水平上。

（一）母植物的水平

当植物的来源取自于它们原来产地时，以下特性需要考虑：a、在气孔的孔隙中有空气污染物的影响，从而影响到光合作用的速率；b、某些寄生物与寄主的相互关系；c、不同类型的共生现象。可以提议，为了处理好标准的材料，在试管培养之前能有效地创造一些中间步骤，或者把植物的一部分嫁接到一个情况良好的砧木植物上去，或者是将用在试管里培养插条。这些方法的其他优点是使酶系统适应于带进人工合成培养基里的组分。另外，母植物的准备，通过选择适宜的基因型，采用有性或体细胞杂交，育成单倍体或亚单倍体而随之以染色体加倍的方法。

（二）外植体的水平各种因素如生长素的浓度-温度- 光照条件或其他各种物质对器官、组织、细胞和原生质体在试管培养中形态发生的影响十分类似。这意味着缺乏专一，性，对进一步研究形态发生的控制的机制带来一定的障碍。为了明确解释这个问题，需要使用最简化的体器和最简单的培养基去创立一个形态发生的突变体，或去比较同属的一个起促进作用的和另一个起阻遏作用的两种基因型。烟草的薄表皮层和表皮下层（烟草和RMB₇一个难处理的杂种）显示出一定的比较专一的反应。

花（100%的外植体各形成20 ~ 50朵花）、芽、根类胚体结构、愈伤组织或完全不能形态发生（尽管供应适宜的生长激素而外植体保持不变一没有细胞分裂）等五种形态发生模式，可以从表皮下层含有叶，绿体的相同的细胞层有选择性地予以设计。这个选择，能借控制下面一些因素而获得：① 为了明确基因型，细胞的固有状态，以过氧化合物同功酶的某种类型标志其特性是有效的；② 对于特定的细胞的固有状态，目前附加到琼脂培养基里的三个因素（葡萄糖、吲哚丁酸、激动素）的相对比例，决定形态发生的类型；③ 所有细胞分裂素试验（玉米素、6－苄基嘌呤（BA）、γ，γ- 二甲丙烯氨基嘌呤（ZBi）、激动素），只有激动素被证明在花的形成中有效果；④ 葡萄糖、吲哚丁酸和激动素适宜的组合对于花的形成有利的，如从培养基中除去琼脂，偏离原来的发育规律而向芽的形成发展；⑤ 把许多具有一定直径的玻璃珠、装进液体培养基可使重新形成花；⑥ 这个效果部分地与细胞内和培养基的pH有关。即使pH是一个共同因素，在这里所得到的形态发生反应的选择性（全部或单一的效果）设想在形态发生控制中膜的重要影响。

在我们了解形态发生的分化的机制之前，我们只能考虑形态发生的控制，但是没有考虑其调节。主要的限制是缺乏适宜的实验系统和没有十分精细的：分析技术。

对未来研究的展望

（一）应考虑的一般问题

1. 抑制或刺激：作为最引人注目的形态发生的类型之一一一完整植物的开花一一我们一直不能对文献里积累的所有混乱不清的资料，提出一个合理的解释。我深信其主要原因之一是对待现象的片面性。我已经获得一些结果使我相信，是开花抑制、的概念而不是成花激素刺激的假说。更为明确的，如果一株植物不能开花或不能表达所要求的一种形态发生类型，可以设想这是由于抑制作用引起的结果。四十年后，当试图提取开花激素已经失败，植物生理学家近来只能转到抗成花激素嫁接。

2. 抑制网络结构的调节：薄细胞层的概念：器官、组织和细胞之间相互联系的网络结构的概念，是一个“抑制过程”的结果，当引用到难以得到开花的其他种或分生组织时，已得到实验的证实。这个抑制的网络结构的概念，促使我凭借一个薄细胞层的概念，已经尝试逐渐地分离器官、组织和细胞内部、联系的网络结构，且试图揭示新的形态发生潜能。

3. 多细胞或单细胞：当从事于植物或动物形态发生时，我们是面对通过不同时间和空间的细胞周期显示出一定的形状、结构和功能的一个多细胞体系。即使在多细胞体系暂时地改变成游离的细胞或原生质体而不久形成的细胞团，这也是适用的。自从在细菌里发现基因调节机制后，虽然我们在多细胞体系中试探重新发现这种控制的一般机制。由于多细胞的机体具有它先天的物质的梯度变化，因而缺乏完全同步结构，促使我们认真地考虑空间范围要与时间范围相结合。发现在较高等的有机体中的DNA是包含在核膜内。从细菌内所发现的一些现象，可能提出不同的疑难问题。

4. 形态发生的特定标记：在大多数情况下，因为一定的形态发生类型的产生，可能起因于第一个原始细胞内建立的物质梯度变化，我们已经几乎武断地分析决定和考虑到，生物化学的和分子的变化可能不是直接的关联到正确的形态发生的过程。这些变化，可能与由不同程度使其发展的“形态发生显著发育的区域”，其同一接种体的某些部分相当有关系，或这些变化产生于两个区域。这是特定标记的疑难问题。那个受梯度的影响缺乏同步和匀质，它是梯度变化固有的规律，致使作出生物化学和分子数据的解释有困难。这些看法促使我们必须将生物化学的、生物物理的和分子的分析与形态学的、解剖学的、组织学的、细胞组织化学和基础结构研究相结合。

总结这些一般的认识，似乎试图建议作为同一难题所有方面的设想以及来分析器官发生的区域和无器官发生的区域。我们集中力量不仅对试管里显示其形态发生能力的基因型上，而且在难以对付的一些基因型方面，作出艰难的尝试是有用的。

（二）应深入研究的一些疑难问题

在比较适宜的实验系统下，欲在生物化学和分子水平上对调节细胞分裂、生长和分化的系统作分析之前，一些基础的疑难问题，依然要继续回答的。诸如① 细胞的形态变化问题。在有生命的体系中，形态结构与功能是统一的。尤其应该注意的一些细胞形态变化的普遍现象，像圆形细胞变成固柱形或肾脏形；气孔的保卫细胞启动和从表皮细胞诱导单细胞毛的实验；不是从愈伤组织上而是从器官的碎片中出现芽的原套结构；细胞分裂具有一定的方向性和细胞的接触点具有一定，的质地以及愈伤组织的质地在形态分化中的重要作用等问题；② 通过细胞膜控制外部和内部物质的梯度变化以及外来信息的传递问题。外部的不同信息如何被细胞内部觉察到，而细胞内部又怎样能调节细胞的表面？如同已知的植物卵磷脂刺激淋巴细胞分裂一样，植物生长激素作用于膜的渗透性可以用来作为有趣的研究工具；③细胞间的相互关系和识别问题。胞间连丝的存在和数量对形态发生的分化程度的关系必须予以测定。在体细胞胚胎发生中，已经显乐出母细胞内的子细胞群，被许多胞间连丝相联络，以及球形的细胞群被外壁所隔离。这种既可交往又可隔离似乎是胚胎形成所选择的条件。同时在分化的整个过程中，又可以随着二个邻近细胞对相同信息的不同反应而定，这在含羞草叶枕的较高部位和较低部位的膨压变化不同和叶枕细胞中存在很多胞间连丝，这可说是经典性的所谓“位置信息”。所有这些都涉及调节细胞分裂，即细胞间相互关系的原始状态的基本问题；④ 有丝分裂和减数分裂问题。是什么因素决定细胞的分裂方式？细胞分裂是一个相同的基因组分配到两个子细胞的过程其细胞分裂在完整植物体所表现的特性如何？细胞分裂中需要生长素和细胞分餐素的控制，其机制作用的研究已经发展到生物化学和分子的水平。此外，细胞周期的控制问题及其细胞核和胞质的活动过程的最本质问题等；⑤ 核迁移和不均等分裘问题。因为核迁移可能是细胞分裂中决定性的步骤，几乎总是在与形态发生的变化有着密切关系的不均等分裂时，首先发生核的迁移到细胞质的一定位置。未来的分化类型，已经在第一次细胞分裂发生之前就被预订。究竟什么因素决定这个过程？伴随细胞壁的形态发生，细胞质流动的速率，应该牵连到蛋白质的易变性问题，是值得研究的有趣因素。不均等分裂的普遍现象，也启示人们研究对细胞质中细胞器的重新分配等问题。⑥ 应用肿瘤细胞来探讨形态发生的问题。由于肿瘤细胞经Ti质粒DNA、RNA病毒诱导，借着染色体的不平衡和在去掉激素的合成培养基情况下，也有持久细胞分裂的能力，以适应整个细胞的分化，这在正常的细胞中是不能达到的。利用Ti质粒DNA的在烟草上诱导冠瘿的试验研究，已揭示对形态发生有关的重要方面，比如染色体的畸变和高度瓦解和活跃细胞分裂团块的组成；肿瘤细胞可以形成苗而不能分化根；欲完成任一器官的生长必须接连地嫁接到正在生长的植物上；起源于单细胞的畸形组织所得到的嫁接植物种子，可以观察到恢复正常的现象，而且还应用于试管花器官形态发生及其形成的后代的研究等等均是有兴趣的问题。同时，更有趣的是一个外来的质粒用原生质体来研究基因的媒介系统，可应用来作为细胞分化的有价值的标记。不谈及它对基因工程的重要性，就从试管里脂旨质体中间体Ti质粒DNA被原生质吸收，对于研究发育也是很有希望的技术。

[Ann. Rev. Plant physiol.，1981年32：291~311]