卫生部上海生物制品研究所副研究员何葆光及其领导的细胞生物研究室的科研人员，在采用基因工程技术研制乙型肝炎疫苗的工作中，作出了重大贡献，填补了国内在这一领域中的空白。以下是何葆光副研究员接受本刊记者采访时的谈话。——编者。

乙型肝炎简称乙肝，是世界上广泛传布的一种病毒性疾病。我国是世界上肝炎、肝癌高发区。以十亿人口计，仅带毒者就有一亿人左右。由于母婴之间能垂直传播乙肝，假如母亲是乙肝患者，婴儿免疫功能低，传染这种病的比例就相当高。感染后约有90%的婴孩演变为慢性带毒者。不仅如此，乙肝与原发性肝癌的发生有关系。一般情况下，乙肝高发区的原发性肝癌的罹患率也高。因此就迫切需要乙肝疫苗来控制这两种疾病的发生。

现在的肝炎疫苗不像麻疹疫苗等，生产有困难。麻疹疫苗，是取自麻疹病人的病毒，在组织细胞里培养，生成很多的麻疹病毒，经处理成弱毒后，没有感染性了，再给小孩注射，这就是疫苗了。甲型肝炎病毒能培养，乙型肝炎病毒就培养不出。因而现在的乙肝疫苗是以病人的血为原料，即把抗原抽提出来做疫苗。现在美国这种疫苗的价格是100美元一个人份（即一个人要预防乙肝要花100美元）这称为第一代乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗有不少缺点。其一，它是来自病人的血液，这本身是否人道？无疑这对患者的健康是有损害的；其二，由于原料是取自患者的血液，有些感染性病毒如去除不清反而可能导致发病，所以必先要进行黑猩猩安全性检验。最近国外有一种病症，称为获得性免疫缺乏症（AIDS），这也是一种病毒病，得了这种病，就没法治了，由于该病的发现，乙肝疫苗的销路大大下降。当然，作为—种过渡性疫苗，它还是可用于预防婴儿被母亲感染。但作为一种面向全体人民的、长远性的解决办法则是不太现实的。

第二代乙肝疫苗就是基因工程疫苗了。乙肝病毒是直径为42毫微米的球形颗粒，可分为表面的包被及27毫微米的核心两部分。核心是有感染性的#包被是制备乙肝疫苗的有效成分，无感染性。所含抗原称为乙肝表面抗原（HBsAg）。患者血中经常存在单由病毒包被组成，直径为22毫微米的颗粒。病毒的核心中存在着乙肝病毒的基因组，这是长度为3200个核苷酸的环状脱氧核糖核酸（DNA）分子。其中乙肝表面抗原和核心抗原的编码基因相隔一千多个核苷酸。

乙肝基因工程是用人工的方法把乙肝基因克隆化后再进行加工，把所需抗原的编码基因切出来，与其他生物具有各种特殊功能的基因片段按一定方式相连后输入到其他活体中，使它人为地产生乙肝抗原。用此法产生的HBsAg可制备疫苗。它可无限制地大量繁殖，并且由于有感染性的部分在加工过程中早已切除，故疫苗是相当安全的。

美国加州大学旧金山分校是世界上第一个进行这一工作，也是最早获得表达的（1982年）。日本是1983年1月发表论文，我们也是1983年得到表达。我国的表达量已达到试生产的要求。

乙肝基因工程的第一步就是设法使乙肝基因克隆化，得到其蛋白质的编码基因。一般得到蛋白质编W基因是用信使核糖核酸反转录制得互补DNA（cDNA）的途径。此外，在所需基因没有插入顺序的情况下，可以直接克隆DNA。我们两条途径都经历了。得到了带HBsAg全部编码顺序的cDNA，也得到了乙肝的整个DNA克隆。

基因工程加工基因最基本的宿主是大肠杆菌。本世纪七十年代初期，在美国斯坦福大学考恩教授（Cohen）实验室里从事研究工作的一位华裔学者（Annie Chang）在研究细菌的抗药性物质基础时发现，细菌里有一种小分子的DNA。把这个DNA分离出来，称为PAC质粒（就是以这个中国人的名字命名的）。这是对一种大家司空见惯的现象——抗药性，进行了研究并深入地进行了钻研，发现了一种质粒、这质粒抽出来并转移到一种没有抗药性的细菌里去后，该细菌就具抗药性了。由此看出，抗药性的物质基础是一个质粒。这种质粒能自身复制，分子量不大，可在一个大肠杆菌里自身繁殖。其后又发现了功能各异的众多的限制性内切酶，这样就可把各种基因，包括人的基因，进行重组并复制。这就是基因工程的开始。所以提这段往事，可以看出对一种常见现象的研究，深入地探讨，往往能导致科学上的重大突破。另外也表明，我们中国人在这方面并不比外国人落后。当然，一提基因工程就要讲大肠杆菌。因为基因加工的场所就是大肠杆菌，没有它就不可能获得那么多的同一拷贝的基因。譬如肝炎病毒，血里只有那么微量的一点，第一步就得把它取出来，把其中的DNA抽出来，这是感染性很高的。许许多多的血里抽到最后只剩下极其微量的DNA，再用酶去切，把质粒联上，种到大肠杆菌里，就可以无限繁殖得到取之不尽的细菌了，所需的基因也随之可源源不断地获得。以上所述，乙肝基因工程疫苗的加工、装配、复制全部是在大肠杆菌里。但最后一步——在大肠杆菌中的表达，却很不理想。按理，生长激素、胰岛素等用大肠杆菌都表达成功，肝炎疫苗本来预计也是可以成功的。核心抗原1979年在大肠杆菌中获得表达，而关键的表面抗原却未能表达。核心抗原除了主要作诊断之用外，对预防肝炎并无大用处，世界上许多知名的实验室都未能使表面抗原在大肠杆菌中获得表达。我们所也做了这些实验，我们用的是cDNA，这在世界上尚属首次。但也未能获得稳定表达。表达不好有两种可能：一是大肠杆菌确实不是合适的宿主，大肠杆菌中的酶把表达产物吃掉了，或是大肠杆菌本身不具有折叠成乙肝抗原所需空间结构的能力；二是HBsAg基因中有小的插入顺序也不可能表达。总之，迄今大肠杆菌尚未能成为HBsAg的合适宿主，这是客观情况。

这以后就转向酵母。真核细菌里最简单的是酵母。为要使HBsAg在酵母中得到表达，首先要把HBsAg基因与宿主的启动子相连，有的还要加上特定的选择基因及与复制稳定性有关的基因。启动子是表达强弱的关键。启动子能起识别作用（我们实验室加工了磷酸甘油酸激酶启动子）。具体的步朦是：先把酵母整个磷酸甘油酸激酶基因用酶切割，严格控制切去的长度，使该基因的启动子部分留下，而结构基因去掉，再接上人工接头。但酶是做不到严格控制长度的，故要把大量含启动子、但长度不等的质粒菌种进行详细分析，才能找到所需启动子质粒，然后把肝炎的结构基因接到原来酵母的结构基因的位置上，酵母就误认为是自己的成分，而进行加工。这样就得到了肝炎的蛋白质。拼接时，有时多一个核苷酸或少一个核苷酸都不会表达。

以上是很简单地介绍，实际上欲要使肝炎疫苗在酵母里表达，除要有酵母的启动子外，还要有酵母的选择基因及酵母本身的质粒成分（包括复制子等）。选择基因我们选用亮氨酸基因。我们知道用的酵母宿主菌是亮氨酸营养缺陷型。当培养液中没有亮氨酸时，它就会死亡。据此我们给它一个质粒，质粒里有亮氨酸基因，有了这质粒输入到酵母菌里，即使培养液里没有亮氨酸，它照样也能生长，因为基因本身可带来生成亮氨酸的能力。我们把它放在一个无亮氨酸的培养基里，菌撒在上面，没有质粒的都死光了，有质粒的就存活了。这就是我们所需要的酵母菌了。由于所有基因的加工都在大肠杆菌中进行，因此就需要上述大肠杆菌质粒的复制子及酵母选择基因所组成的穿梭质粒。酵母还有一个特点，它能把乙肝表面抗原装配成一个像血蛋白一样的颗粒状，有较好的免疫原性。我们实验室从连续20批大瓶培养试验的结果证明HBsAg表达量已达到需扩大为中量试验的水平。根据电镜观察说明产生的HBsAg自身联成与病人血浆中的HBsAg相似的颗粒状。用初步提纯的HBsAg免疫动物一针即可诱发特异抗体。根据对流免疫电泳、酶免疫分析及动物免疫原性结果，该溶菌上清HBsAg含量基本上与HBsAg强阳性血浆相近，但其成本比HBsAg阳性血浆低。

基因工程解决了HBsAg表达的问题。下一步是纯化，把它们制成乙肝疫苗，经临床试验考核后投产，还有相当多的工作要做。乙肝疫苗在1982年时还认为有三代：第一代血苗；第二代基因工程疫苗；第三代化学合成疫苗。但1983年以来，随着乙肝基因工程疫苗研制的迅速发展，它比化学合成多肽疫苗的效率遥遥领先。虽然现在尚无一个工厂获准正式生产此种疫苗，但临床实验的大量结果业已表明，此疫苗具有极大前途。我们有理由这样说，人类征服乙型肝炎的时代已为期不远了。

（江世亮整理）