生物工程可恰当地形容成多学科的综合体,包括化学、生物化学、生物学和工程学,用于解决特定的问题。食品、化工、制药行业的许多产品是通过生物学过程生产的。
在所有生物工程过程中,原料通过一定反应物中的各种生物学变化产生预期的产品。单细胞蛋白(SCP)的生产大多受到生物工程过程的控制。改进SCP的产量、生产率、质量可通过使该过程的各个阶段尽可能完善来达到。
研究范围
在少数研究中报道了利用遗传工程改进SCP生产[表1]。为数不多的研究中反映出复杂的遗传工程工艺处理SCP微生物的不足之处,很少有人注意到原料的利用率,尽管有些人注意到应增加SCP微生物的培养基的选择范围。其它有关SCP微生物改良的方法涉及产品回收和SCP发酵后的过程。细胞蛋白质的分离,促使从SCP发酵物中回收蛋白质(Udaka et. al 1981)。其它有关改进细胞裂解和SCP性能也有研究(Boudrant et. al 1979,Jamas 1983)。
与改良SCP微生物的进展有关,必须建立必要的生物反应器和控制系统。一种完善发酵条件和提高生产率的方法是应用计算机控制系统。
利用啤酒酵母生产SCP
生物工程的最新进展促进在试管内构成重组基因,并转移到特定的基质受体中。显著不同的原核生物和真核生物,通过遗传工程处理,结果产生新的合成与分解代谢机能。尽管许多酵母菌株能成为SCP的来源,大部分成熟的对SCP生物体进打遗传学处理的[艺适用于啤酒酵母(S. Cerevisiae)。啤酒酵母是通过传统的和重组DNA方法处理,以产生商产的SCP或改莕SCP生产过程的合适候选者。
现在的DNA重组工艺水平允许许多基因的非自然状态在试管中组成,并且新方法能在啤酒酵母得到特定的外来站因。唯一的限制因素是生物工程的创造范围和在啤酒酵母受体中的相容性。
培养基的利用:
生产SCP所用的培养基选择由如下几种因素决定,包括成本、可用性和SCP微生物的分解代谢能力。除了某种己糖包括葡萄糖和半乳糖外,啤酒酵母不能利用其它各种类型的培养啤酒酵母菌株的改良使其能分解代谢其它培养基,低成本的培养基显然有利于SCP的生产。
乳清和农业上的生物大分子是两种有希望的培养基,乳清和半纤维素大分子的主要成分分别是乳糖和木糖,乳糖和木糖不能被啤酒酵母所代谢,显然闪为缺乏代谢它们所必需的酶。
能利用乳糖的啤酒酵母菌株的建立,允许啤酒酵母在乳清中生长。不能利用乳清的啤酒酵母菌株应归结于缺乏乳糖转运系统和β - 半乳糖苷酶,这种酶能水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖。将β - 半乳糖苷酶基因密码从乳酸杆菌(Kluyveromyces lacte)无性移植入啤酒酵母内(Dickson1980),K. lactic基因在啤酒酵母内表达并且使β - 半乳糖苷酶表现出活力。但啤酒酵母菌株仍不能生长在以乳糖为单一碳源的培养基中,这是由于:虽然乳糖能被含有无性移植的卜半乳糖苷酶基因的啤酒酵母水解,但它不能将乳糖转送入细胞。
啤酒酵母不能利用木糖作为单一的碳源,尽管这个代谢机理尚不清楚。木糖能够被转运到细胞中去(Cir1968),并且啤酒酵母能利用木糖的氧代异构体——木酮糖(Wang and Schneider,1980)。所缺少的催化机能是需要有能将木糖异构化成为木酮糖的酶。利用遗传工程的解决方法是引入能使木糖异构化的酶——木糖异构酶的基因密码,木糖异构酶在多种原核生物中可以发现,包括E. Coli、Salmonella typhimuium、Lactobacillus和Streptomyces。大肠杆菌(E. Coli)木糖异构酶基因无性移植入啤酒酵母在酵母/E. Coli质粒中。E. Coli木糖异构酶在啤酒酵母中是稳定的,但它不能表达(Batt et al 1984)。现在努力的焦点在于利用天然的酵母助催化剂来表达木糖异构酶。
增加啤酒酵母的培养基范围将允许SCP生产利用许多廉价的基质,并因此而降低生产成本。问题是需将新的培养基与它们的代谢物统一成受体啤酒酵母的正常生化途径。不仅需要啤酒酵母合成新的酶类。
而且培养基的多少必须考虑适当地平衡辅助因素和代替完整的代谢作用的其它代谢功能。新的以生物生理学为基础的控制手段必须加以发展。
营养成分:SCP的营养成分取决于收获期间生物体的代谢状态和产生最终产品的回收过程因素。必需氨基酸的平衡决定质量、消化率和SCP的生物利用率,就如所包含的组成成分决定蛋白质的利用率。
蛋白质含量和某些特定SCP源的品质部分地决定于它们所生长的培养基。啤酒酵母的氨基酸含量在数量和质量上不同于其它的酵母菌株。酵母菌株的氨基酸成分表明对蛋白质的有效率有影响。氨基酸成分的不同反映了不同有机体的不同代谢产物,正如基因密码对于个别生化途径的控制一样。
改变氨基酸库的平衡可由某些生物合成途径脱离控制来完成,以求产生超常量的限制氨基酸。限制氨基酸合成物的增加可以利用调整限制氨基酸合成物的生化反馈结构来实现。一种相似的手段成功地利用大部分革兰氏阳性菌进行商业化的氨基酸生产。
在几项尝试中报告了改良的氨基酸高产啤酒酵母菌株。许多分离氨基酸高产细菌的原理适用于啤酒酵母菌株,尽管控制氨基酸生物合成和积聚的基础不同,将会得到解释。限制氨基酸高产的酒酵母分菌株的改良减少在SCP产品中添加氨基酸补充物。
此外,蛋白质成分能通过遗传工程嵌入合成的多核苷酸片段而使特定的氨基酸增加。这种处理已被通过嵌入多联G-C片段来更改PBB322氨苄青霉素酶蛋白质所证明,这样使大肠杆菌电的氨苄青霉素酶蛋白质中的脯氨酸增加。
细胞的裂解
SCP的蛋白质生物利用率受到细胞裂解程度,即细胞的蛋白质成分释放程度的限制。多种方法可用于裂解酵母细胞,包括高压、冻融、声波、化学处理和酶处理。细胞自溶是裂解酵母细胞引人注意的方法,尤其这样不需添加化学试剂(如盐)或耗能(如加热),因而降低了SCP生产成本。
一种S. Cerevisiae JD 109的温度敏感裂解突变型已经分离成功,它能在37°C时裂解而并非随意的温度。S. Cerevisiae JD 109的裂解在pH8比在pH5.6时更容易,并且细胞内的蛋白质含量也从45%减少到35%。哪部分遗传损伤是S. Cerevisiae JD 109细胞自溶的原因还不知道,但必定包括细胞壁的某些破坏。啤酒酵母自溶突变型的裂解在对数生长期出现最多,并且开始于温度变升的1 ~ 3小时内。
容易裂解的啤酒酵母菌株可通过化学诱变得到。导入溶解酶例如Zymolase的基因密码,使酵母受到能在适当阶段被外来因素激发的酵母助催化剂的控制是得到自溶性啤酒酵母菌株的可行方法。对发展其它的自溶性啤酒酵母菌株的限制涉及到突变菌株的活力。自溶突变型必须在不存在诱发细胞裂解的动因时保留自然的生长能力,并且蛋白质的含量在允许的条件内。这种工艺能应用于新的调味品生产系统的发展,以及蛋白质的回收。
前景展望
尽管对真核生物蛋白质合成的表达方式认识还不够完全,这种方法已有成功的进展,并且实现了在啤酒酵母合成异体蛋白质。首先基因对于所期望的表现型负有责任这是一致的,它们能决定在试管内得到预期的结果,很清楚,可以产生具有新性能的蛋白质。如前述,唯一的限制因素涉及重组基因在受体内的适应性。任何对受体有害的“无性系”产物都是明显不稳定的。
当一种外来的激发动因存在时,助催化剂的使用关系到预期的基因机能(例如:细胞自溶)的表达,有助于改良生产SCP的啤酒酵母菌株。合适的激发动因包括温度或化学诱导物。这种由外来因素激发遗传机能的方法,推动了两个阶段生产SCP过程的计划,就如通过不同的发酵过程生产。例如:传统的发酵方法能产生酒精,在传统的发酵完成之后,用过的酵母能在第二发酵阶段通过外来的激发动因使之“转向”出现期望的SCP特性,而用于SCP生产。
改良的啤酒酵母菌株具有新的分解代谢能力和功能特性,使之能应用于SCP生产外的其它领域。分离得到的啤酒酵母自溶突变型可用于生产酵母自溶物例如:调味品。
开拓酵母SCP新的应用领域是可能的,如果生物工程能搞清相应的控制基因并设计通过遗传工程来处理它们的方法。
[Food Technology,1984年2月]