1983年春，诺贝尔奖金获得者David Baltimore形容一项DNA重组技术的新操作尚处于“胚胎状态”。不料6个月后，James Gusella领导的研究小组报导说，他们利用这项限制性内切酶切割DNA技术，发现了在第4染色体上的亨丁顿（Huntington）氏病（一种无法治疗的神经系统进行性变性）基因的一个标记物。

该项发现对于成人患者的早期诊断和产前检测该病基因带来了希望。迄今为止，已经了解亨丁顿氏症基因是一个典型的，显性孟德尔式遗传的基因。每个亨丁顿氏症患者的孩子，都有50%的可能性得这种病。由于亨丁顿氏病要到生育孩子的年龄才出现症状，故此，患者的子女在有他们自己的孩子之前，无法知道自己是否患有这种病症。

借助这个新的标记物，（即与亨丁顿氏病基因靠得很近而与它连锁遗传的一段DNA），研究人员所面临的处境就可大为改观。除了研究出一种症状出现前的试验方法外，研究者们还可能分离出亨丁顿氏病基因，并了解它如何导致患者进行性地丧失对运动神经的控制和智力衰退，最终，他们甚至还可能矫正这种遗传缺陷。

这是科学家们第一次运用限制性内切酶技术来定位可能存在于人类基因组的某个基因。Allen Roses说：“Jim Gusella在亨丁顿氏病上做了非常重要的事情，他推出了某种未知疾病的基因诊断法，去定位致病基因。”

新方法带来的希望远不局限于亨丁顿氏病，也可用它来定位3000 ~ 4000种其他遗传病的标记物。被切出的标记物有不同的长度，称为“限制性（内切）片断长度多态性”（RKLPs）。

给遗传学带来革命

“RFLPs给人类遗传学带来了革命，”Kenneth Kidd说，“在了解BFLPs以前，我们仅有约20种普通标记物，而这些标记物中的某些又不能足够地靠近基因。”由于限制性内切酶将所有染色体剪成片断，而这些片断的长度又因遗传疾病而不同，故RFLPs提供了未知疾病基因潜在标记物的丰富源泉。

举例来说，Kidd正在75个有亲属关系的人中搜寻RFLPs，这些人属于一个家庭，有患多发性内分泌瘤Ⅱ（MENⅡ）的家族史。多发性内分泌瘤Ⅱ基因是显性遗传的。它影响甲状腺的癌症，像Huntington氏病一样，这种病在35岁以前，也不表现症状，那担患者在他们有病之前也可能有了孩子并将MEN Ⅱ基因传给孩子。

在Gusella的实验室里，对其他遗传病也正进行着研究。他和同事们已经着手研究诸如肌张力障碍（一种运动性机能失调），神经纤维瘤病（一种影响神经系统的病变），Wolf氏综合症（一种可导致精神发育迟缓的病症），以及一种性连锁形式的肌营养不良。除了在马萨诸塞总医院进行他的搜寻基因的工作以外，Gusella还将他的专门知识提供给一家叫“Integrated Genetics”的生物技术公司，这家公司正在利用RFLPs来寻找数种疾病的标记物，包括囊性纤维变性和亨丁顿氏病在内。

RFLP方法

这种对定位疾病基因具有如此巨大潜力的方法，是在10年前，在研究酵母和病毒基因时首次使用的。由麻省理工学院的David Botstein和Utah大学的Ray White等四位科学家于1980年发表的里程碑式的论文，促使科学家们认识到这种方法在人类遗传学中的可应用性。

该项技术有两个重要的组成部分：即限制性内切酶和放射性标记探针。以一种限制性内切酶处理单个细胞的DNA，会产生数千个片断，为了找到位于某个疾病基因附近的很少几个片断，要使用克隆的DNA片断作为探针，来搜寻互补DNA。

当研究者在DNA上使用限制性内切酶时，这种酶只能在称为识别部位的专一性核苷酸顺序上切割。尽管所有的人都具有容许一种特定的酶切割的不变部位，在各个基因组上分散开来的每100 ~ 200个碱基对，由遗传继承下来一些核苷酸的改变可创造或消除一些识别部位。于是，由母亲可能遗传下一组限制性部位，而由父亲遗传下另一组。结果，他们的每个子女当其DNA，以某种限制性内切酶和某个探针处理时，便显示出两个不同的片断模式。

如果在一个家庭里，一个模式是由患病成员的DNA产生而不是由正常成员产生，那么这个模式——或多态性——便可用来作为该病基因的标记物。

由于没有办法预言一个标记物的形式——由遗传继承下来的多态模式——伴随着一种疾病基因，因此，寻找标记物的科学家们必须检测由数代组成的大家系，在这种家系里患病的成员是已知的。

例如，Gusella和他的同事们利用两个家庭来追踪亨丁顿氏病的标记物。从一个有25个活着的成员的美国家庭所做检测来看，显示一个与该病基因连锁遗传的标记物处在第4染色体上。对一个约有570个成员的委内瑞拉家族所做的检测也证实了这种连锁，这个家族的所有成员都与一位一个多世纪前因亨丁顿氏病去世的妇女有亲缘关系。然而，在委内瑞拉这个家族中，与该病相联系的那个特定标记物模式与美国家庭的那个标记物模式并不相同，说明标记物本身与该病基因并无作用关系，仅仅是指明它的存在。

良好标记物

Botstein是RFLP技术的先驱者之一，他说，迄今为止，极少有足够精确的标记物可用来诊断疾病。包括仍处于实验阶段的标记物中的一个是亨丁顿氏病标记物。对这个标记物的精细确定的工作还在进行中，这样可使它更为可靠。

Botstein指出，“如果人们掌握有一个真正紧靠在一个基因两侧的多态标记物，那么确诊率是极高的。”Gusella和他的同事们目前正在为亨丁顿氏病基因寻找这样的另一个标记物，即处在另一侧翼的标记物。

“多态性越多越好，”Botstein说，他认为理想的情况是，一个标记物至少应以5致10种形式存在，这样一个人就容易从其双亲的每个身上继承下不同的标记物模式。由于它们的杂合性，这种匹配被称作是“可提供信息的”。

去年，当Gusella小组报导为亨丁顿病基因定位了一个标记物时，他们发现一种称为Hind Ⅲ的限制性内切酶和一种称为G8的探针产生了一个具有4种形式的标记物。自那以后，该小组已发现5种其他的酶分别连同G8探针使用，也能产生与亨丁顿氏病基因连锁的多态性。Gusella小组的一个成员Rudolph Tanzi说，“以Hind Ⅲ处理不能提供信息的家庭，在使用这些其他的酶时，可能变得能提供信息。”他又补充指出，继续进行研究，对亨丁顿氏病的诊断检测当能在一到二年内达到。

已知染色体和基因

亨丁顿氏病的一个标记物的发现，证明RFLP技术对于在染色体缺陷和由此导致的生化异常都未知的情况下追查疾病是理想的。但是，该技术对于掌握着更多资料的研究者同样是有用的。例如，如果一个疾病基因已经作图在一特定染色体上，RFLPs提供了一条极好途径来精确确定其位置。

Ross说：“我们获知肌强直性营养不良的基因已作图在19染色体上时，我们停下了自己实验帘里正在做的任何其他工作，来寻找19染色体上的RFLPs”。他集中了500个属于6个大家系的人员，这些人有罹患该病的家族史。该病是成人肌营养不良的最常见形式。虽然他尚未发现这个疾病基因，他用来寻找这个基因的RFLPs却有可能为一种诊断试验提供基础。迄今所得到的结果看来是富有希望的。Roses在他检测过的90%的家庭成员中，他已经能够确定该病基因是否存在。

甚至在疾病基因本身已知的情况下，RFLPs也可以是有用的。举例来说，1978年，旧金山加利福尼亚大学的Yuet Wai Kan和Andrée Dozy，利用血红蛋白基因来寻找镰状细胞贫血症的标记物。今天，一种RFLP试验形式已广泛用于产前检测这种疾病。血红蛋白基因也为另一组血液病，地中海贫血症提供了标记物。

在已知基因的情况下对病进行探索的另一成功例子是苯酮尿症（PKU），这是一种因缺少一种分解苯丙氨酸的酶而致的病。常常在很小的儿童便因为累积的氨基酸而导致脑的损害。研究者们报导说，从那个导致该代谢疾病的基因获得的RFLPs，可能允许用来做产前诊断和携带者检测。产前诊断能保证对婴儿喂以特殊食物，使该病造成的影响达到最小。

尽管在镰形细胞贫血症，地中海贫血症，苯酮尿症上的发现超过了Gusella所做的工作，他的工作仍然是意义重大的。因为这是第一次用去寻找一个基因的标记物，这个基因可能存在于46个染色体中任何一个染色体的任何地方。现在，Gusella知道亨丁顿氏病基因是位于第4染色体上，一个包含有几百万个碱基对的区域里。

Gusella的最终目标之一，也是所有RFLP研究者的一个目标，就是使用RFLP技术去实际定位一个疾病基因。但这可能需要开发另外的技术。White说：“发现一个标记物并不意味着发现那个基因将变得容易起来。”他补充解释说，在比较简单的生物像果蝇，科学家们在一个遗传标记物的任一侧可以检查或“巡视”一个50万个碱基的区域，但这样做时要花费大努力。

搜寻与作图

White，Botstein和其他在四年前写下那篇如今已成经典论文的、论述RFLP技术的科学家们，还提议研究者们通过寻找位于1到2千万个碱基对间隔的RFLPs，来制作人类基因组的连锁图。他们指出，如果几百个这样的标记物可以利用，那么，它们中的一个或二个就很可能会与何任单个基因引起的疾病靠得足够近而表现出连锁关系。

不管在像亨丁顿氏病之类的病症中所取得的孤立的成功例子，White和Botstein仍强烈地持作遗传图的策略。White说：“探索遗传疾病的最有效途径是首先制作人类基因组的遗传图。”

“许多人在基因组上四处搜寻和到处乱啄，希望他们也能像在亨丁顿氏病那样啄中目标。”Botstein补充道。“标记物的数目仍然太少，以致给一种疾病作图不具有很高可能性。”

然而，那些搜寻基因标记物的人则不同意Botstein等人的看法。Beaudet说：“我不怀疑褒性纤维变性病基因将在今后五年内被发现并被克隆。”此外，Roses说，一张包罗详尽的连锁图也只能解决部分与寻找疾病有关的问题，“为了得到这种连锁关系，你仍然必须有患病的病人和大的家系来进行研究。”

不管在策略上有何分歧，主张作图者和主张搜寻者都为可以在基因基础上而不是症状基础上诊断疾病的前景所激动。按Kidd的话来说是，“RFLPs突然把人变成了像几十年来一直是当作遗传学研究对象的果蝇、脉孢菌、玉米那类的遗传生物。”

[Bio Science，34卷7期]