编者按：在我国的高技术发展规划中，生物工程技术是被重视的首项技术之一。新的生物工程技术的出现将能加快改造动植物的进程。原复旦大学生物系助教朱培坤采用首创的外源遗传物质必威在线网站首页网址 导入法，继完成高等植物亚纲与纲间的杂交后，又获得了超门杂交植物：蘑菇一一卷心菜及其无性繁殖的子一代。远在美国明尼苏达大学的朱培坤应本刊之邀，为读者撰写了这篇文章，并提出了“转化学”的新概念。我们期望被许多外国科学家所重视的“必威在线网站首页网址 导入法”，能够为改良我国的植物起有效的作用。
高等植物遗传工程的转化技术与机理是目前生物科学研究领域中的热点之一。今年不足半年的时间，在英国出版的《自然》杂志就刊登过三篇有关高等植物转化方法的文章[1-2，17]和一篇评述文章[3]。国际学术界重视高等植物的转化方法，说到底是因为通过真核生物遗传工程的手段可以有效地改造高等植物，从而创造出大量符合人类需要的植物。近来在国内，继必威在线网站首页网址 导入法又产生了细胞穿壁技术［11］。海内外围绕高等植物的转化方法进行了许多研究。本文试就高等植物遗传工程的转化技术与理论提出一孔之见，以期引起读者对这一问题的讨论与兴趣。
在国际学术界，关于高等植物遗传工程的转化方法主要有四项：
一、含有Ti质粒的农杆菌转化T-DNA［12］；
二、DNA直接导入植物原生质体［13］；
三、向某些植物的某些器官，例如黑麦的花蘖注射外源DNA［1］；
四、用电脉冲法向原生质体或细胞导入外源DNA或用含有DNA的高速微粒飞弹向植物细胞导入外源DNA[14-16，2]。
这四类方法均有其特点与局限：将外源DNA与Ti质粒重组后转化植物，虽有个别例外［17］，但大多局限于双子叶的某些植物，并且往往需要用组织培养方法获得转化植物；将DNA直接导入植物原生质体的方法，必须首先解决从原生质体分化植物的困难；向黑麦花蘖注射外源DNA转化率较低，仅为0.7%，并且至今无重复的工作报道；用电脉冲方法也碰到原生质体分化成植株的困难，而用高速微粒飞弹向植物细胞射入外源基因，仅见到洋葱的工作并且可能较难普及推广。上述方法促进了植物遗传工程转化理论与技术的发展，但从技术本身来看，对受体细胞的性质还有必要进一步作深入考虑。从学科角度来看，对植物遗传工程的转化法应予以理论的探讨。
基因转化中的供体、载体与受体，这三者是各有特点又相互紧密联系的。供体研究的重点是目标基因与各种工具酶；载体研究的重点是寻找合适的能携带目标基因专一进入植物细胞的质粒DNA，例如Ti质粒、花椰菜花病毒DNA等；受体研究的重点是向受体细胞简捷地导入外源基因及在接受外源基因后能迅速地在个体水平上表达外源遗传信息。某些转化方法虽能将外源基因导入体细胞或性细胞，但是如果我们不仅从整体角度考虑导入外源基因，而且考虑向怎样的细胞导入外源基因，进一步考虑受体细胞的生长期以及如何快速获得转化的植物，将促使对转化方法（Transfer method）的研究变成对转化学（Transferology）的探索。如果转化学能够成立，那么目前最主要的研究内容是什么呢？从当前转化的实际状况看，除了原生质体与某些植物花蘖的孢原细胞外，应该寻找更适于作为受体的细胞；除了用针注射、用电脉冲输入、用飞弹穿入外，应该寻找更适当的途径将外源基因导入受体细胞；除了用组织培养外，还应该寻找更好的方法使转化细胞分化成新个体。另外，还应该研究受体细胞接受与排斥外源DNA的机制；探讨决定多基因性状的外源DNA导入受体细胞后，表达多基因所决定性状的机理；细胞的核基因或质基因分别或同时因与外源DNA的重组而引起细胞生理生化变化的规律；转化细胞快速分化成杂交个体的规律；外源基因在杂交植物及其子代的稳定性条件等等，均是转化学值得深入研究的课题。先从实际问题讨论。
现在有一只蘑菇和一棵甘蓝，请您用最简单的方法使蘑菇与甘蓝杂交，并且这蘑菇 - 甘蓝要表达蘑菇所属的性状。由蘑菇 - 甘蓝杂交植物的照片（摄影者系美国明尼苏达大学遗传与细胞生物学系博士John H. 和博士研究生陈克勤）可见杂交植物具有蘑菇的某些性状：白色，无叶绿体与叶绿素的斑块嵌在甘蓝的绿叶上，获得这样的蘑菇——甘蓝几乎不需成本，但需要几周的时间。蘑菇是食用菌，甘蓝是双子叶植物，它们的种属差距非常遥远，横跨不同的亚界。怎样转化呢？笔者所用的供体是蘑菇汁液（既可能有蘑菇染色体或片断，又可能有许多蘑菇DNA），受体是甘蓝的分生组织细胞，不用载体，直接转化。
在此以前，我与我的同事曾经在国内公布过叶用甜某——甘蓝（日间杂交植青物）［6］、青菜——马兰（亚纲间杂交植物）［5,10］与大蒜——青菜（纲间杂交植物）［9］杂交成功的信息。今天有幸在《Betway必威在线登录 》上首次公布蘑菇——甘蓝（亚界间杂交植物）完整植株的照片。当然，高等植物超远缘杂交［7］的横杆还在上升，这一点，用不了多久，读者就会看到事实。获得这些超远缘杂交的植物，在技术上的关键点是将植物体上的某些分生细胞作为受体细胞，并通过适当处理，在加剧分生细胞分化的同时向其导入外源遗传物质，然后又巧妙地获得完整植株。另外，对分生细胞作为受体细胞的优越性作过一些考虑。
分生组织的分生细胞是具有胚性的细胞，有很强的分化能力，它们本身处于原质体状态，细胞内部的结构还未完全构建好，因此分生细胞是一种构建中的细胞，而其它组织的许多细胞是构建好的细胞。对于构建中的细胞，可将它想象成建筑工地，而构建好的细胞，可将它想象成建造好的房子，某些遗传工程师往往将一般细胞的胞壁去掉，即形成原生质体，然后再导入外源基因。这样做是否有点像将造好的房子敲掉壁，对室内结构再换装新的材料呢？如果是，这将给换装的工程带来许多困难：首先，由于一般组织的细胞基本上停止了分化，因此要它再变成构建中的细胞，谈何容易；其次，因为这些细胞的内部结构已经基本定型，因此要偷梁换柱十分困难；最后，就是外源基因导入了细胞内，由于建筑时期已经过去，因此受体细胞实际上不需要这些外源材料。相反，如果我们用分生细胞作为受体细胞，这些细胞处于分化期，多少像一个建筑工地，需要外源物质，加之，人为地促使这些分生细胞加剧分化，从而变成一个繁忙的建筑工地；这时，外源物质包括外源基因导入进去，容易被受体细胞接纳并且得以重组。另外，对于分生细胞来说，它是薄壁细胞，新陈代谢旺盛，可与外界频繁地进行物质交换，这样它又提供了容易导入外源基因的另一个条件。
另外，从遗传工程的转化来看，总是希望受体细胞的排外能力越小越好。对于婴孩来说，其免疫系统不完全，对外界的抵抗能力较差；对于嫁接来说，年轻的果树作接穗容易改变其性状。因此选择胚性强的细胞——分生细胞一一作为受体细胞，有可能具有较弱的排外能力，从而有可能容易接受外源基因。
可以想象，在适当的措施下，如果我们在分生细胞加剧分化的同时，向分生细胞导入外源基因，即便于外源基因的导入在细胞内的重组，又能够较快地再分化，形成的新的组织与器官上表达外源基因。如果这器官是幼芽，那么，将其发根就可得完整的转化组织，蘑菇——甘蓝植株的获得仅需几星期而已。
分生细胞外有薄壁，怎样导入外源基因呢？孤立地看，一个细胞似乎无路可循，非脱壁不可。但是，如果在植物体上看一个分生细胞，这个细胞与外界发生频繁的物质交换，显然存在许多通道与交换形式。中国学者是比较重视植物穿壁现象的［18-19］，由于这些学者对植物穿壁现象的研究，使得有可能在导入外源基因的方法上发生变革。在1984年，笔者曾经提出，利用植物穿壁运动，有可能建立一项新的生物工程技术[4，5，6]。后来，必威在线网站首页网址 导入法与植物穿壁技术均采用植物穿壁运动的理论与某些成果，前者往往采用物理的方法，例如，机械损伤的办法加剧穿壁运动，据报道透露，后者往往采用化学的方法造成穿壁运动；前者往往采用植物体上的分生细胞作为受体细胞，后者有可能采用原生质体或单细胞甚至细胞团作为受体细胞；前者往往不采用组织培养技术，后者往往采用组织培养技术。尽管有这些不同，但是重视与应用植物穿壁运动这一点是相同的；从整体角度看，植物穿壁运动是植物细胞间交流物质的一种方式。我们可以巧妙也利用这一方式，将外源基因导入受体（分生细胞），并且使这些外源基因与受体DNA发生真组，与此同时，DNA重构已经重组的受体细胞，又同时分化成变异的新芽，从而获得遗传结构变革的植物。
对于多基因系统决定的性状，显然用单基因的导入是无法奏效的，因此，有时候最好能应用多基因工程的概念，改变多基因决定的遗传信息［8］，“手榴弹”导人法，可能是目前有效的方法。所谓“手榴弹”导入法，就是将多基因的遗传物质直接导入受体细胞，将纯化的供体DNA，甚至将供体的组织器官汁液直接导入受体细胞，有可能表达外源多基因决定的性状，进入受体细胞的遗传物质，它的重组与表达，与手榴弹爆炸一样是随机的。有时候也可将几个已知的重组基因（单基因）同时导入受体细胞，希望得到表达多个基因决定的一些性状，这个方法与“手榴弹”法差不多，可称之为“散弹法”但是不管采用什么导入法，均要注意的是，尽量进行精确的定向与定量导入，通俗地说，就是掷手榴弹业要看准目标掷。要做到这一点，就要对性状与望门表达的关系进行研究，了解得越清楚越好。如果某性状明明是质基因决定的，但是你却导入核基因，这样，就难以获得这质基因决定的性状。另外，要注意不同的种属（甚至同一种但不同品种的植物）有可能对不同的外源基因表现出不同的亲缘性，往往要通过大量的实践才可能获得这样的信息。了解这一问题，对外源基因在转化植物中的稳定性研究是有益的。
实现成功的转化是需要长时间摸索的。由于转化的对象非常复杂，有各种各样的植物，不能千篇一律地套用一个模式。笔者的经验是，如果以不同种属的植物来划分，可大体分为双子叶植物的转化与单子叶植物的转化。这两大纲的植物，转化的方式差异较明显，特别是单子叶植物，其转化难度较大，如用农杆菌转化单子叶植物，目前大多数情况无能为力，如采用原生质体，又碰到组织培养难于脱分化的困难。就是应用必威在线网站首页网址 导入法，也要作一些技术调整，才能将外源DNA导入单子叶的分生细胞中去并得到表达外源基因的植株。如果以不同的供体来分，又可分为单基因导入与多基因导入，而多基因导入法又可分为DNA直接导入法，有遗传物质结构的细胞器导入法，染色体及其片段导入法甚至汁液导入法。总之，按不同的需要，采用相应的合适的导入方法，才能合理地获得所需转化植物。
转化学还应重视受体细胞分化成个体的研究。当受体细胞导入外源基因后，由于遗传结构的变化，将带来细胞生理生化的变化，从而使得组织培养的配方发生许多类型的改变，这种情况有时给工作带来较大的麻烦。因为，在短时间内弄清组织培养基配方是件困难的事。那么，怎样才能简捷地获得转化植物呢？除了在繁殖器官上动脑筋外，笔者认为要重视一种现象，当漫步在森林或果园时，有时会看到在树基部萌生出新芽、如果将这新芽剪下发根就会获得新的完整植株。只要找到适当的方法，就可以使许多植物直接在体上萌出新芽新株。笔者将这种不通过组织培养而调动利用植物体本身的分化能力获得分化芽株的方法，称为植物整体诱导培养技术，也可称之为活体组织培养技术。由于整体诱导培养技术既不需要配培养基，又不需要无菌操作，因此，当受体细胞因外源基因的导入发生遗传及生理生化变化时，不论是何种类型的变化，均可简捷地获得转化芽枝。整体诱导培养技术是离体组织培养技术的补充，也可能是新的发展。
对于从事遗传工程转化的研究来看，对转化植物知鉴定是应重视的，这种鉴定大致可分为个体器官学鉴定、组织细胞学鉴定与分子生物学鉴定、这三种不同层次的鉴定是相辅相成的，不能相互排斥。例如：梨与苹果杂交，得到梨苹果，从形状与味道就知道这是梨与苹果杂交的品种，不能因为没有分子生物学的证据而否定它。但是，如果能在分子生物学上分析蛋白质与核酸的变化，这无疑将更深入地揭示杂交品种的本质。另外，这三种不同层次的鉴定是相互关联的，特别是某些生物化学的分析往往介于组织细胞学与分子生物学之间。关键是善于抓可靠的明显的鉴定指标，例如，选用白化植物DNA作为供体，导入非白化植物细胞后获得了白化植物，这一性状就可鉴定杂交成功。又如蘑菇与甘蓝杂交，本来是一片绿色的甘蓝叶片出现了许多白色小斑块/也能说明蘑菇与甘蓝杂交后某些性状的表达。尽管如此，我们应重视生化证据。目前，国际上对于植物遗传工程转化成功的分子生物学证据，往往将抗卡那霉素的基因作为标记基因，经转化获得的植物用卡那霉素筛选抗性，然后测定相关特异酶NPTⅡ酶，有时候也选用适当的质粒在体外重组卡那霉素基因与NOS基因，转化后先测定对卡那霉素的抗性再测定NOS基因的产物（特异酶）。最后用Southern blot来验证外源DNA整合的证据和SI核酸酶保护来验证外源基因的表达或用Northern blot验证RNA杂交。但是，植物遗传工程毕竟是要用种类繁多的外源基因去改造各种受体植物，因此，不可能单单转化抗卡那霉素基因，给验证带来许多困难。在转化多基因DNA时，往往难于寻觅DNA探针，因此对表达产物蛋白质进行Western blot验证，也能在蛋白质水平上确认杂交成功的证据。对于绿色植物的遗传工程，RuBP羧化酶（组分Ⅰ蛋白）的电泳特性也是可靠的杂交成功的验证指标。
综上所述，关于植物遗传工程转化学，是研究受体细胞及其相应个体导入、重组与表达外源遗传物质的科学。转化学是一门边缘学科与交叉学科，它的兴起将促进生命科学与生物工程的迅速发展。
我国是一个农业大国，因此，发展生物工程技术特别是植物遗传工程技术是发展我国经济的重要决策。最近国务院将生物工程技术列为十大技术发展之首，说明了研究遗传工程的重要性。但愿植物遗传工程的转化技术与转化学，不仅成为在实验室工作的科学家手中的攻坚武器，而且也能成为亿万知识农民在田间地头获得优良植物品种的有效武器。只有这样，才能使地球迅速改变面貌。
参考文献
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1987年8月于美国明尼苏达大学植病系。
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作者现在通讯地址：美国明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学遗传和细胞生物学系。