80年代初尚未见到业已证明在一个基因工程植物上表达外源基因的报道。此后情况发生戏剧性的变化。带有选择性标记的质粒载体的研制成功使得在植物上进行基因表达和调控的大量研究易于进行。在这些研究方面有的是着重于在遗传转化的烟草植株上把TMV基因序列作为核基因，研究当其表达后对病毒侵染引致的症状表达的抑制；也有的是研究萤火虫荧光酶基因在遗传转化烟草植株上的表达。尽管某些双子叶植物对土壤细菌——根癌农杆菌这一天然的基因转移系统反应良好，但是构成对人类营养需求来说最重要。的一类植物——禾谷类植物却仍然未见反应。直到最近为止，把重组DNA技术应用到任何禾谷类植物上的机会似乎仍然很小。不过，随着这些植物的细胞生物学和组织培养知识的增加为在分子生物学和植物育种之间架设了一座相互沟通的桥梁。目前已经取得的大量进展使得对这些植物也能够通过基因转移技术进行基因操作。

非禾谷类植物的基因转移

新的DNA顺序引入植物后，外源蛋白质的产生量将取决于基因转录和转译的速率以及mRNA和蛋白质的稳定性等因素。对载体构建的研究已经鉴别出能够控制许多基因功能的强启动子。

经过详细研究的这些启动子包括从根癌农杆菌冠瘿瘤诱导质粒（Ti）的T-DNA区段上获得的胭脂碱合成酶（nos）启动子和花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S转录启动子，把这些启动子重组入细菌抗生素抗性基因编码序列的上游。这就有可能产生在植物中发挥功能的嵌合基因。嵌合基因的一个例子是细菌氨基葡萄糖苷（又称新霉素）磷酸转移酶Ⅱ基因受nos或CaMV 35S启动子的控制。新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTⅡ）基因是从细菌转座子Tn5获得的，它编码对卡那霉素的抗性，其作用原理是通过磷酸化作用产生解药性。该基因可以用作显性标记用以选择被转化的植物细胞。现在从根癌农杆菌的Ti质粒可以得到各种类型的载体，最广泛使用的载体是切除T-DNA的致瘤基因片断而代之以嵌合基因或其它令人感兴趣的基因，细菌基因在植物中的表达受到所用的启动子的影响，对矮牵牛的研究表明，CaMV35S启动子驱动的NPTⅡ基因的表达至少比nos启动子高一个数量级。

另一些研究把细菌氯霉素乙酰基转移酶（CAT）编码顺序用作标记基因（它提供对氯霉素的耐性），结果表明，CaMV33 S启动子在转化的烟草或矮牵牛中的表达活性几乎比nos启动子提高30倍；另外，在遗传转化植物的所有器官中它均为组成性表达。

这些研究的操作程序是叶圆盘转化——再生，该法是将基因转移和植株再生结合为单一过程，即在表面消毒的叶片外植体上接种合适的根癌农杆菌株。这种技术可以应用到那些对根癌农杆菌的侵染产生应答反应又容易从叶片外植体再生植株的植物种，特别是茄科植物包括矮牵牛、烟草和番茄。

对包括矮牵牛和烟草在内的几种双子叶植物来说，转化愈伤组织和转化植株也可以通过将来自原生质体的细胞或细胞悬浮物与根癌农杆菌在—起共培养来获得。这些操作步骤开拓了对根癌农杆菌的自然侵染特性的研究。

用细胞壁降解酶处理植物细胞可以获得原生质体。尽管可以容易地从大多数禾谷类植物合适的细胞悬浮培养物分离出原生质体，这些原生质体也能诱导再生出细胞壁，并经历持久分裂以产生愈伤组织，但是还没有证据表明这些禾谷类原生质体衍生细胞在与根癌农杆菌共培养后能产生转化的愈伤组织，即使使用像乙酰丁香酮和α - 羟乙酰丁香酮这样的化合物（它们有激活Ti致瘤基因（Uir）和T-DNA从根癌农杆菌向双子叶植物细胞的转移效应）也显然不能引起水稻中的任何转移反应。有报道指出，玉米幼苗能被致病的根癌农杆菌樟鱼碱和胭脂碱株系转化，从这类转化的幼苗中可以检测到樟鱼碱（Opine）。然而这个报道的证明有待于T-DNA分析。根据近来的发现，樟鱼碱合成并不是转化组织所特有的现象。

由于根癌农杆菌诱导的基因转化在禾谷类植物中难以成功，人们对其它基因转移方法的兴趣逐渐增强，这些方法包括DNA直接吸收、植物原生质体与球状体（细菌原生质体）的融合，通过脂球体为媒介的DNA传递以及DNA微注射法。与DNA直接作用确实是—种合乎逻辑的发展，因为似乎不存在分子生物学上的原因，那一适合于转移入禾谷类植物的新DNA顺序不会经历转录和转译的过程。包括禾谷类植物在内的单子叶植物其细胞壁的组成成分不同于双子叶植物，特别表现在细胞壁基质交联多聚体上。这种差异或许是产生相互作用的主要障碍的原因，利用原生质体与直接基因转移相结合的技术希望能克服这种障碍。

向禾谷类植物转移基因

利用原生质体对包括大麦在内的植物原生质体吸收DNA的一些早期的研究表明，染色体、质粒和噬菌体DNA还有附着细胞核的某些DNA都可以被原生质体吸收。多聚 - L - 赖氨酸和多聚鸟氨酸（PLO）此类多聚阳离子能促进这种吸收过程。此后，直接把Ti质粒与矮牵牛原生质体在PLO存在下相互作用，结果转化成功由此证实了只要有农杆菌存在即可。这一发现揭开了向植物原生质体直接进行基因转移研究的序幕。可是，这种转移技术的最大转移频率仅达每10⁵个植物原生质体中有一个转化的原生质体（即1/10⁵）。用PEG诱导Ti质粒向烟草原生质体的转化频率与之相似。其后对质粒传递方式的比较证实PEG是一种能够刺激质粒传递入原生质体过程的选择性化合物。由于这种基因转移系统必须使用原生质体而且转化频率低，所以极少用在双子叶植物上。即使该法能获得抗卡那霉素植株，它也不能与通过根癌农杆菌的转化系统相提并论。然而，无论是将损伤植株或其外植体与根癌农杆菌直接作用或是将原生质体制备细胞或细胞悬浮培养物与该菌在一起共培养，以根癌农杆菌为媒介的基因转移在禾谷类植物上均难以成功，因此有必要重新评价用DNA直接吸收来转化禾谷类植物这一方法。

禾谷类细胞获得稳定的转化的证据是二倍体一粒小麦的原生质体通过直接的基因吸收所获的实验结果。该实验所用的质粒是经过改造的PBR-322，它包含玉米转移元件Ac，nos启动子和NPTⅡ基因。从细胞悬浮培养物分离出原生质体在PEG存在下与质粒一起保育，培养几天后把正在分裂的细胞接种于固体琼脂糖培养基上，用100 μg/ml卡那霉素选择出抗性克隆，这些克隆具有NPTⅡ酶活性。不过，转化频率仅为1/10⁶，这与以前通过Ti质粒获得的矮牵牛和烟草转化原生质体的频率相一致。此外，由一粒小麦的细胞悬浮培养物分离而得的原生质体虽然能够形成小的愈伤组织但不能再生成植株。

与此同时通过直接基因转移成功地从多花黑麦草得到了转化细胞。这个转化是将原生质体与一个嵌合质粒pABDI在一起作用下完成的。pABDI带有选择性标记基因NPTⅡ，由CaMV的启动子、终止子和翻译起始信号来控制。使用之先用限制性内切酶使质粒线性化。烟草原生质体的Ti转化基本上采用PEG吸收程序，但是另加一次热激处理（45°C处理5分钟继之以0°C处理10秒）。其转化频率仍较低（大约为1/10³）而且转化细胞克隆也不能再生成植株，其他研究者也发现pABDI构建物用PEG吸收法是成功的。例如，甘蔗原生质体被转体，在80μg卡那霉素/ml选择压力下被转化的克隆其选择频率大约为1/10⁷。这些克隆也表达出NPTⅡ活性。可是实验设计中增加一次热激处理，甘蔗系统的转化频率未能提高。

有报道指出从悬浮培养细胞分离得到的水稻原生质体用PEG诱导的质粒吸收能获成功。通过带有nos启动子、NPTⅡ基因和CaMV终止子区段的质粒构建物，用卡那霉素（100μg/ml）来选择被转化的原生质体克隆。这个系统的转化频率显著提高达2%。从这些转化子中检测到NPTⅡ酶活性，Southern blot杂交证明这些克隆也带有高拷贝量的外源基因，它们可能已整合到染色体上。虽然在这些研究中使用的质粒包含有从Ti质粒的T-DNA获得的nos基因，但是现有的关于胭脂碱合成的证据是相互矛盾的。不过近来的实验证据表明在未转化的愈伤组织中精氨酸代谢的结果能够产生樟鱼碱，从这一点上来看上述现象就不足为奇了。

通过电穿孔的基因转移植物原生质体的基本生物学特性与培养的动物细胞在几方面相似。电穿孔（Electro poration）方法是将细胞置于一个高电压的电脉冲下，从而诱发细胞膜产生一个可逆的通透性变化。目前正成功地将这种方法应用到禾谷类植物的瞬时或稳定的基因转化研究中。电穿孔技术在将克隆基因引入哺乳类细胞的研究中已经获得极大的成功。

在最近的几个研究中，包括利用禾谷植物的原生质体，电穿孔技术已被用来引入DNA以监测瞬时基因表达。有人用电穿孔法将带有nos和CaMV35S启动子的嵌合质粒引入胡萝卜原生质体中，电穿孔后24—48小时，通过检测CAT活性来估价基因转移入胡萝卜原生质体的效率；基因转移效率与DNA浓度，电脉冲振幅及其持续时间以及电穿孔介质的成分等因素有关。胡萝卜系统的最佳基因转移条件对烟草、玉米原生质体也是有效的，用带有CaMV启动子的构建物在玉米中能获得最高水平的CAT活性。

在另一个相似的研究中，把玉米Shrunken基因与从Tn5转座子中获得的NPTⅡ基因融合用来研究这个启动子在小麦原生质体（从细胞悬浮培养物中分离）中的功能。电穿孔后4天NPTⅡ表现出最大活性。这个研究也表明被引入的DNA其构象在植物细胞内从超螺旋分子改变成开放的环状和线状分子。只有线状分子在电穿孔10天后的原生质体中仍然保持着。在这个原生质体系统中大多数引入的BNA分子被认为是以额外染色体形式存在。

有证据指出：线性单链DNA和双链环状DNA分子可以参与从根癌农杆菌DNA向植物细胞的转移，所以值得探索利用单链DNA作为对禾谷类植物原生质体直接转移基因的可能性。水稻、小麦和高粱的原生质体也被用来研究CAT基因与CaMV34S启动子或与果蝇的Copia长末端重复启动子融合后CAT基因的表达问题。

除上述短期实验外，电穿孔法也已经用来进行玉米原生质体的稳定性转化的研究。所用的玉米原生质体是从悬浮培养的细胞中分离得到，超螺旋化质粒带有CaMV35S启动子和NPTⅡ基因。被转化的正在分裂的细胞能抗100μg卡那霉素ml，表达出NPTⅡ酶活性的克隆的选择频率大约为1/10⁴。

通过对植物原生质体与质粒直接作用中影响稳定转化效率的因素的系统性研究，从而使转化频率显著提高。当利用烟草原生质体和经SmaⅠ限制性内切酶处理成线性化的pABDⅠ质粒时，直接基因转移的效率比以前采用的综合理化处理的操作技术所获的基因转移效率要高1000倍。这样，对原生质体施加热激处理、调整PEC1的最佳浓度，若在DNA加入后向原生质体介质中加入PEG同时注意电穿孔过程所用的起始电场强度能使烟草原生质体的转化频率提高到2%。如果精心改进电穿孔设备的设计及间接方式，将这些综合处理应用到各种禾谷类植物原生质体转化实验中，似乎亦应当能增加其转化频率。

利用脂质体和细菌原生质球虽然过去的注意力主要集中在化学诱导的质粒吸收、电穿孔或者这些方法的综合应用上，但是通过人造脂球体包装DNA的方式把质粒DNA转移至禾谷类植物原生质体上去的基础理论研究也已开展起来。这种方法亦已显示出转化烟草原生质体的能力。包含有适当质粒的细菌原生质球正以相同的方式在利用着。这方面研究使人们对基因转移所需要的最佳条件的认识得到提高。在水稻上评价过这种途径，在由悬浮培养细胞获得的原生质体与根癌农杆菌原生质体融合而成的克隆中有1/10⁴的融合子能合成T-DNA特异的樟鱼碱。

DNA微注射法及其它DNA传递方法近年来发展起来的将DNA注射于原生质体细胞核的技术是一种有效的基因转移方法。向紫花苜蓿原生质体的细胞核进行微注射其转化频率达26%。由于根癌农杆菌对紫花苜蓿难以实现遗传转化，这一结果是令人振奋的，微注射法是对原生质体进行单一操作， 所以不需要利用标记基因来选择转化体。

—个具有重要意义的进展是利用电脉冲把外源核酸导入植物细胞，采用这种方法将TMV RNA直接导入分离的烟草叶肉细胞，24天后约有50%的细胞表达出TMV RNA，这种“电注射”（electro injection）技术越过了原生质体分离这一必要步骤，它对禾谷类植物的悬浮培养细胞可能是有用的。

根据近来的研究结果，玉米如果用在其T-DNA上随机插入联体玉米条斑病毒的重复拷贝的根癌农杆菌接种，植株能产生病毒侵染所引起的症状。根癌农杆菌能够将玉米条斑病毒DNA转移到玉米上，这一发现对目前所认为的根癌农杆菌的寄主范围提出了疑问，现在有可能用在T-DNA上携带其它联体病毒DNA基因组重复拷贝的根癌农杆菌来对其它禾谷类植物进行类似的研究。联体病毒并不是种传病毒，这可能限制了它们在通过根癌农杆菌为媒介的病毒侵染来进行遗传转化评价上的应用。

另 一个具有广阔前景的禾谷类植物转化途径是把嵌合质粒DNA注射入黑麦分蘖花穗，这个方法也不涉及到组织培养技术。有人假定DNA是通过植物的液泡系统转移至黑麦的生殖细胞，如果生殖细胞正处于一个称之为“有能力”的阶段的话。观察到的转化频率较低（约为0.07%）。还应当确定是否在其它禾谷类植物中也会出现相同的“有能力”阶段。玉米植株用含有供体植物的混合花粉进行自花授粉，每穗中大约有10%的籽粒带有转化胚乳，但是在以后的世代中这种频率则大大降低。

禾谷类植物转化系统的用途

禾谷类植物的转化系统使得在禾谷类植物中研究外源基因的调控成为可能，这可以和编码热激蛋白的玉米基因在矮牵牛中的表达系统以及小麦基因在遗传转化的烟草幼苗中受植物色素控制的表达系统相比较。对水稻来说，以入噬菌体为载体已经构建了它的基因组文库，人们试图鉴定和克隆出能够进行人工染色体构建的DNA序列。

目前业已证明，把不同来源的DNA的混合物加入烟草原生质体中，能够获得毫不相关的外源基因的共转化子。通过基因直接转移获得共转化，这一技术提供了一种快速而又简便的向包括谷类植物在内的植物基因组引入无选择特性的基因的途径。在烟草中，其原生质体用Ti质粒转化，被选择出来的组织中发现也有与小牛胸腺DNA（在吸收步骤中用作运载体DNA）同源的DNA序列，同时Ti质粒序列整合入这些组织的核基因组上。在另外一些试验中，有47%以上的卡那霉素抗性克隆也有非选择能力的nos基因表达。

在双子叶植物中以根癌农杆菌为媒介的转化目前已获得成功。禾谷类植物面临的问题是如何提高转化的频率以及如何从已转化的原生质体有效地再生出可育植株。载体构建方面的进展比DNA传递和影响禾谷类原生质体植株再生诸因素等方面的研究进展要快得多，大有取而代之之势，正如贝顿（Burton）所强调的那植物育种是一种“数字游戏”。成功与所使用的材料的数量直接成比例。基于育种改良目的，禾谷类植物上成功的基因转移需要高频率的转化和有效的转化植株的再生相结合；此外，启动子序列的基础理论研究亦需要有一个高的转化频率。

在最近召开的洛克菲勒基金会议上报道了_种从原生质体有效地再生水稻植株的方法。从胚乳、叶片、根或花药的悬浮培养细胞获得原生质体，先进行一次热激处理（45°C，5分钟），然后转移至固体琼脂糖培养基上培养，所获的克隆直接在无激素培养液中，基本上经过体细胞胚胎发生过程产生绿色植株。由粳稻品种台北309、Fujisaka5和Nipponbare分离得到原生质体到植株再生最快只需7周的时间。分裂好、快速生长的悬浮细胞系对水稻原生质体的有效分离、分化及此后的植株再生是必不可少的。来源于原生质体的克隆其中10 ~ 20%是通过体细胞胚胎发生方式形成再生植株的。有必要采取在水稻上业已证明是成功的方法来估价玉米、小麦、大麦及其它禾谷类植物的组织培养以便使从适当的悬浮培养细胞分离得到的原生质体能够保持持续的分裂；同时监控植株再生过程。从水稻或其它禾谷类植物的幼苗或植株直接分离得到的原生质体至今仍无经过持续的分裂形成克隆的报道；理想的途径是直接从禾本科植物分离得到原生质体然后获得再生植株。

正如近来所强调的那样，通过重组DNA技术成功地完成基因操作有赖于以下二个方面，其一，基因型与表现型之向关系如何？其二，期望的基因序列能被容易地分离和克隆。单基因性状的转移，例如已经报道的在某些双子叶植物种中存在的除草剂抗性，目前对水稻来说其技术是可以借鉴的。终于这种可能性将扩展到所有主要禾谷类。然而，大多数农艺上期望性状的改良，例如产量、抗病虫性、抗逆性以及光合效率等均涉及许多未知特性的多基因。利用可转移元件有可能从转座子插入序列的周围位点分离得到特征性DNA，从而鉴定出控制特定性状的基因。玉米的几个可转移元件的分子特性已弄清，因此可以用作特异探针从因可转移元件的整合而诱发的突变体中分离基因。对光合作用、真菌致病性及溶液吸收性状控制的深刻了解也开始为基因操作提供了新的可能性。近年来发现和鉴定了α - 羧基 – D - 阿拉伯糖醇 – 1 - 磷酸，它能作用于Rubp羧化酶的加氧酶，因而是一种内源性光合作用暗反应过程的抑制剂。这就为基因操作提供了一个靶子。有实验指出，植物几个质酶是植物中重要的抗真菌剂，它也可以用作基因操作的另一个靶子。还有报道表明，一个能够提高辨别钾、钠能力近10倍的因子位于小麦4D染色体的长臂上。虽然对单基因性状来说，由核编码的基因已能成功地将其转移入染色体并得到表达，但是同样的方法却无法应用到由细胞器编码的基因上。

不经过重组DNA过程而使用体细胞融合技术在不需要详细了解所涉及的基因的情况下，也可以打破有性杂交障碍来转移基因。在这方面，目前水稻上正在利用原生质体融合技术来转移细胞核或细胞质基因。这样就可以用栽培水稻与带有像耐盐和抗真菌或病毒特性的有用性状的野生稻融合从而可能得到体细胞杂种。通过原生质体融合也能获得细胞质雄性不育性转移的细胞质杂种。体细胞杂种有利于产生杂交的禾谷类植物也有利于研究杂种优势问题。总之，禾谷类植物的基因转移需要把细胞培养和分子生物学方法紧密结合起来，利用这些新技术禾谷类植物的遗传改良才能取得有重大意义的进展。

[Science，1987年6月5日]