具有重要经济价值的禾谷类和其他禾本科作物通常很难于进行体外操作。已经证明，由单细胞再生植株是异常困难的，而这是细胞和分子操作的前提。因此，这类植物至今仍在植物生物技术的主流之外。胚发生组织培养是由单个体细胞形成的胚来再生植株，它的发现和开发，导致了几乎所有重要禾本科种类植株再生有效程序的发展，并在玉米、水稻和甘蔗等作物中由原生质体获得了成熟的植株。这些成果以及体细胞杂交的成功、外源基因在禾本科植物细胞和植株水平上瞬间和稳定的表达，为这类粮食作物的遗传操作和改良提供了机会。但作者认为，更多地了解植物的生长、发育（包括体外形态发生）、生理和分子生物学及遗传学，并与植物育种学家和遗传学家不断进行对话和交流，对将生物技术这一现代工具有效地用于主要作物种类是必要的。

生物技术有四个主要研究领域：医学、微生物、兽医和植物。全世界普遍对生物技术感兴趣并进行投资的一个重要原因是，它对人类的幸福和经济发展有着光辉的前景。首批产品投入市场是由于生物技术在医学、兽医和微生物上取得了成功，其基础是对病毒和细菌的生物学、遗传学及分子生物学有着广泛的了解。另一方面，生物技术迄今还未能用于改良任何一种主要作物或生产出任何一种植物产品。不过，一般认为植物生物技术对政治、社会和经济的影响最终将和所有其它生物技术的综合作用一样大，尽管要使其潜力得到充分发挥将需要更长的时间。

植物生物技术的前景与潜力的基础在于，利用细胞培养或分子生物学技术来产生更受欢迎（如高营养）或具有其它农艺价值的植物，如对除草剂、病毒或害虫的抗性、无性生殖（通过胚胎培养）和通过能结合两不可交配种理想性状的原生质体融合来获得体细胞或胞质杂种等，以及利用该技术来创造能使有用外源基因稳定整合（通过遗传转化）的植株。这些成果只是在易于操作的模式系统如矮牵牛、烟草、番茄中取得，而在主要作物种类中却未获成功。据推断在模式系统上的成功也可在主要粮食和经济作物（如禾谷类及其它禾本科植物、食用豆科植物以及树木）中取得。但在实践中尚无此证据。

1980年以来取得的重大进展使得进行细胞和分子水平上的遗传操作和对有经济价值的物种进行改良成为可能。这一突破的取得是由于成功地在许多不易操作的物种中进行了胚发生组织培养（体细胞形成能萌发长成植株的胚）。值得注意的是，能有效地用于禾谷类及其它禾本科植物胚发生培养的起始、保持和再生的原理与策略也可以容易而快速地用于其它各种难于操作的种类，如大豆、棉花、向日葵、棕榈，香蕉和树木（如柑桔、檀香、挪威云杉、白云杉、火炬松和黄杉）。

由胚发生组织培养再生植株

直到本世纪七十年代初，在单子叶植物特别是禾本科种类上进行长期愈伤组织培养或体外再生植株的尝试多数都未能成功。这些困难的产生显然是由于人们把适用于模式双子叶植物（如烟草）的方法也用到了单子叶植物上。人们认为单子叶植物不易成功的原因在于它缺乏次生生长能力。后来发现，将高浓度人工合成生长素——一种有效的除草剂2，4 - 二氯苯氧乙酸（2，4-D）加入到简单培养基中即足以诱导愈伤组织，当2，4-D浓度大大降低时植株可以再生。

这些发现导致了首批由禾本科植物组织培养再生植株的报道。到1980年，在很多禾本科种类中都报道了植株的再生，其中包括一些重要的作物如水稻、小麦、玉米、甘蔗等。然而，几乎所有情况下的再生都是偶尔的和暂时的，再生的植株数目很少，培养物及其再生能力都不能保持到2 ~ 4个月以上，并仅限于在少数没有多大经济价值的基因型中取得了成功。这些观察以及所有早期关于再生的报道都认为是由于芽的形态发生这样一个事实，导致了这样的建议，即在多数情况下芽的形成并不是从头开始的，而是通过对原分生组织抑制的解除。

体细胞胚胎发生在1980 ~ 1981年间，出现了几篇通过体细胞胚胎发生再生植株的报道。胚发生培养的特点主要是要求利用来自未成熟器官（如胚和含有未分化细胞的叶、花序）的外植体，并特别要求对胚性愈伤组织及早进行鉴定并有选择地保留。自那时起，在所有重要的禾本科种类包括禾谷类中都得到了有效的长时间的再生。过去认为在禾本科中少见的体细胞发生，现在被看作是体外植株再生的最普通方法。

在形态学上，胚性愈伤组织是密实的、有组织的，颜色为黄白色或淡黄色（Ⅰ型），而非胚性愈伤组织是柔软且松脆的。Ⅰ型愈伤组织生长缓慢，但通过对胚性部分仔细的选择和继代培养，可以进行长期的培养，在典型；型愈伤组织继代培养不能超过几个月的玉米中，发现了一种软且松脆并快速生长的胚性愈伤组织（Ⅱ型），其形成频率较低，但适于长时间培养。胚发生组织培养对新品种、杂交种或营养繁殖种类（如甘蔗和象草）的快速高效无性繁殖特别有用。正在某些双子叶植物中发展的人工种子（包被的体细胞胚）在禾谷类或其它禾本科植物中的利用是值得怀疑的，因为在这些作物中可以廉价地生产大量的天然种子。

胚性细胞小且密集、薄壁、胞质浓厚、高度嗜碱性，并含有许多小液泡、脂滴和淀粉粒。体细胞胚与合子胚一样，都直接或间接地来源于单细跑。然而，在旺盛生长期，2，4-D被迅速代谢，使细胞壁加厚、细胞膨大、液泡化和淀粉粒丢失，引起胚性细胞的不可逆分化或衰老，变成非胚性细胞。因此，必须保持高的2，4-D浓度以保证培养物的座发生特性。

愈伤组织培养并没有提供一种经济的或商业上可接受的能大量生产植株的方法。在生物反应器中生长的胚性悬浮细胞更适于这一目的。虽然这类培养中的植株再生在几个种中（包括玉米）已有报道，但目前所利用的体系还不是很有效的，植株的有效再生还需要很多更深入的工作。理想的细胞系或悬浮系是细小而高度分散的，由小团细胞质密集的胚性细胞所组成，独立于愈伤组织或有组织的分生组织，细胞加倍时间为27 ~ 32小时、并能形成体细胞胚和植株。

外植体的作用胚发生培养的成功取决于根据发育阶段和生理状态对原始外植体的仔细选择。外植体只有在特殊发育阶段进行培养才能得到最好的效果。据认为，DNA的不可逆损失、断裂或甲基化是造成含有分化细胞的老外植体难以再生的原因，尽管其它研究并没有支持这些结论。相反，已发现形态发生能力的大小与内源植物生长调节剂（如脱落酸和吲哚乙酸）的浓度有关。体外也可能存在类似的浓度差异，体细胞胚总是在胚性愈伤组织的表面形成，芽端朝外，根部包在愈伤组织内，表明有着严格的极性生长，这可能受到外源或内源生长生长调节剂浓度或养分浓度的调节。

基因型的作用虽然普遍认为基因型是决定培养中组织反应的一个主要因子，但用大量基因型和不同种类所取得的良好结果证明了许多其它因子的重要性，特别是供体植物生长的环境，外植体的发育和生理状态以及培养基等。基因型效应在发挥作用时可以被上述因子所克服。在玉米和小麦中有报道指出，再生能力的遗传是受多基因控制的，与特定的染色体有关。控制植物生长调节剂合成的基因可能位于这类染色体上，并可能受到发育和生理上的控制。

遗传的变异性与稳定性培养的细胞表现出了广2的遗传变异性。其中的很多变异是由于分化了的体细胞组织的混倍性，但毫无疑问，培养中发生了某些遗传变化，特别是在松脆的非形态发生和器官发生的培养什中。然而，培养的细胞中的变异只有一部分在再生植株中出现，有人认为，在细胞培养中出现的或诱及的随机变异可用于植物育种和改良，不幸的是，所观察到的多数变异既不是新变异又没有用途。当农艺上有益变异偶尔被恢复后，变异株也表现了一些不理想的遗传改变。因此，并不奇怪，至今人们不能在禾谷类、禾本科植物或其它任何重要的作物种类中举出这样一个例子，即由组织培养产生的变异对主要新商业品种的培育有着明确的作用，其中包括甘蔗，它常被引作最有说服力的例子。然而，对变异应用的讨论集中于探讨体外生长中引起遗传不稳定性的因子和培养中细胞遗传保真的重要性，特别是在需要那些有用品种、突变体或遗传工程植物的无性繁殖群体时。因此，通过在胚胎发育中严格选择正常细胞以使胚发生培养不易发生遗传改变并产生真实植株是更理想的。胚性细胞很像分生组织或种系细跑，其稳定性与它们的细胞学和生理学特性有关。胚性细胞中可能出现单基因或其它微效基因的遗传改变，这对理想突变体的获得可能确实更有用。

当体外施加适当的选择压力时，得到了有用的单基因突变体，例如，获得了能过量生产色氨酸的玉米和过量生产赖氨酸的珍珠粟植株。类似的策略可用于获得抗除草剂的禾谷类或其它禾本科作物。相反，在培养时进行选择不可能产生抗多基因性状（如耐盐、耐冷、耐旱）的植株，其作用机制在细胞水平上和整株水平上可能完全不同。

单倍体每一单倍的雌雄配子由于减数重组而具有一套基因组，提供了自然界遗传变异的主要来源。在禾本科、茄科和十字花科的很多种类中，由雄配子（花粉）或雌配子（子房）培养而获得单倍体（和纯合双单倍体）植株已有二十多年历史了。尽管已在几种情况下（如中国的水稻）利用单倍体或双单倍体来培育新商业品种，这一方法的潜力还有待进一步开发。

遗传操作与转化

原生质体的培养与再生所有主要植物转化系统都依赖于根癌农杆菌的Ti质粒。因为单子叶种类，包括禾本科植物，不易受这一病原侵染，所以对这些种类必须发展DNA直接转移方法和其它载体系统。即使在双子叶植物中，由原生质体再生植株也只在几个种中有报道。虽然已发现叶肉原生质体适用于双子叶植物，但在禾本科中从未发现叶肉原生质体能持续分裂，这显然是由于其叶细胞快速的分化和衰老。迄今为止，只有胚发生悬浮培养提供了具全能性的原生质体，从中得到了成熟植株（尽管频率很低），如甘蔗、棒头草、水稻和玉米。在很多种类中存在的一个难题是，由胚发生悬浮培养分离出的原生质体只能得到白化苗。在其它种类中有关于高的原生质体植板率和形成体细胞胚及小苗的报道，但不能长成植株。这些进展要求对全能性胚发生培养的建立、保持和定性做更深入的工作。

体细胞杂交原生质体再生的成功，虽然还很有限，但仍激励了人们进行原生质体融合的工作，得到了珍珠粟+大黍草和珍珠粟+单粒小麦的体细胞杂种细胞系、珍珠粟+甘蔗的体细胞杂种胚、水稻+稗的体细胞幼苗以及栽培稻+野生稻的成熟体细胞杂种植株。在几个体细胞杂种细胞系中观察到线粒体基因组的重排、重组和选择性扩增，由于细胞质雄性不育受到线粒体基因组的调控，因而体细胞杂种或胞质杂种对这一重要性状的转移可能是有用的。要培育独特的、能把耐除草剂或抗某些病原的核或细胞器基因组结合在一起的有用体细胞杂种或胞质杂种，必须发展由未融合或融合的原生质体再生成株的快速方法。

遗传转化聚乙二醇和电击穿被用来将DNA有效地导入禾本科植物的原生质体中，导入的基因已得到瞬间或稳定的表达。转化效率很低，几乎在所有情况下都是根据对卡那霉素或G418的抗性选择稳定的转化体（仅指细胞系）。从转化的玉米胚胎发生系得到的转化植株完全不育。同样，尽管最近从水稻原生质体再生幼苗取得成功，但从转化的水稻胚发生原生质体衍生系得到的只是白化苗。在这些例子中，选择都是利用卡那霉素，它可能与畸形苗的形成有关。此外，多数重要禾本科种类对卡那霉素的高度自然抗性产生了另一个问题。最近通过整合入抗潮霉素或氨甲蝶呤的基因得到了转化的细胞系。其它可以得到的基因，如抗草甘膦或Chlorsulfuron的基因，可能更合适。上述情况下用于外源基因表达的启动子在单子叶植物中比在双子叶植物中效果要差得多，这些启动子是首先在双子叶植物中利用的。因此，单子叶植物需要更强的启动子，从而对转化细胞进行更严格的选择。这一研究由于可以获得标记基因如氯霉素乙酰转移酶（CAT）特别是β - 葡糖苷酸酶（GUS）基因而变得容易起来，它们提供了一种不仅能快速评价转化效率而且也能评价启动子强度和基因活性的方法。

直接注射DNA到幼花序基部，得到了黑麦的转化株。据报道，成熟小麦胚可通过吸胀作用吸收DNA并能萌发长成植株。在这两例中尚无外源基因遗传到后代的证据。

发展能使禾本科植物稳定转化的其它方法这类开拓性研究正由几个小组在做。已证明，用单个花粉粒授粉产生了有活力的种子和植株。也发现花粉粒在微注射后仍保持活力。如果微注射在花粉粒的转化中获得成功，那么就可以用这类方法来获得转化的有活力的种子。由于成熟玉米花粉粒中DNA不再合成，将微注射入的DNA整合到花粉基因组中是不可能的，若利用只发生了两次DNA合成的未成熟花粉（小孢子），则产生了能否成活的问题。应更注意用微注射或鸟枪法把DNA（甚至分离的染色体或染色体片段）直接转移到能再生的完整的细胞/原生质体，分生组织或胚中，这最近看来是有希望的。然而，应该认识到，在多细胞结构中转化一个或多个细胞将产生嵌合体，要用之产生含有外源基因的纯系还需要进行很大的努力。此终，近来发现根癌农杆菌可以（或可以改良为）有比目前所认为的更广泛的寄主范围，包括一些单子叶植物，上述尝试均未能提供一种产生禾本科转化植株的有效方法。但就目前由原生质体或分离的单细胞获得转化植株所面临的困难来看，关键在于积极寻求更广泛的方法来直接转化易再生的器官（未成熟胚、叶基部、花序或茎分生组织）、胚性细胞或原生质体。

结论与展望

本世纪八十年代初禾本科植物胚发生培养的发展，使得这一科中所有重要作物种类都能有效的再生并在其遗传操作上取得了进展。随着更有效遗传转化方法的发展，原生质体培养技术必须在更广泛的种类上改进和发展。目前面临的困难和今后的问题与我们对植物的发育、生理、遗传和分子生物学方面缺乏了解有关。必须克服这一严重缺陷，才能使一般植物，特别是重要作物种类的遗传操作和改良成为现实。此外，目前的转化方法只是随机地整合一个至多两个基因，而多数重要的农艺性状都是多基因控制的，并且要位于特定染色体的特定位点上才能充分发挥作用。因此必须开发能同时直接整合一个或多个基因的方法，尽管更实际的做法是首先转移受单基因控制或其基因已被分离并克隆的性状，如耐除草剂（草甘膦、Chlorsulf uron）、抗虫（Bt毒素）、病毒杂交保护、耐冷性（减冻细菌）和氨基酸过量生产（突变细胞）。也必须认识到，甚至在能得到有用的转化植物后，也必须用常规的育种和选择手段对其进行“清理”和稳定，并进行正规的田间试验。因此，重要的是细胞和分子生物学家与植物遗传育种学家经常进行对话和交流。总之，生物技术作为传统植物育种方法的补充最终将用于改良禾谷类和其它禾本科作物，但这需要长期的努力和更多地了解植物的生长、发育和基因的结构与功能。

[Biotechnology，1988年，第6卷，第4期]