化学杀虫剂存在的问题不仅在于对一般环境的污染,而且许多化学杀虫剂自应用后其使用寿命相对很短,甚至还会杀灭靶子害虫的天然捕食者。因此,培育天然抗虫植物的兴趣正在不断增加。本文评述了通过从其它植物中转移基因而使之产生抗虫机制的转基因品种的可能性。
许多显花植物的有性生殖借助于作为传粉媒介的昆虫而有效,因此,显花植物与昆虫至少共同进化了100万年,而且,由于长期相互作用的结果,昆虫和开花植物的许多形态特征彼此相互适应,例如,兰花靠蛾传粉,而这种蛾特别发育的喙能达到25厘米的距离进入花距以花蜜为食,同时有效地传递花粉。
但是,昆虫的活动并不总是有益的,有许多昆虫也以植物为主要食源,导致作物生产在世界范围内损失约16%,而且这还不包括主要由于喷洒化学药品而采取的保护措施的大量花费。作为对昆虫的反应,植物在长期进化过程中产生了许多保护方法。这样,植物尽管不断地受到昆虫的进攻,损失是有限的,某些植物的生物型能忍耐,甚至抵抗昆虫。自然保护机制可分为物理的(如来自刺或毛的粘性分泌物、厚的角质层)或化学的,文献评论表明,许多不同的化学物质在特殊情况下似乎作为保护剂对抗某些昆虫、真菌、细菌、病毒和动物,尽管在所提到的大多数例子中没有给出一种保护机制的明确的证据,即证明这种结果是由于单一的纯化合物,还是由于在育种项目上它的编码基因遗传与抵抗昆虫相关,这些假定的保护剂可细分成小分子化合物(如生物碱、芥子的油甙和酚)和大分子化合物(例如蛋白质,像凝集素、酶抑制剂、某些酶或其它有毒蛋白质)。
作为昆虫非常重要的食源的种子和果实似乎富含这些具有保护作用的蛋白质。在进化过程中,DNA顺序重新排列似乎在种子中产生多用途分子如双头蛋白酶抑制剂方面起重要作用,通常在自然界中单一机制的保护作用并不是百分之百有效,即植物具有忍耐力,而不是完全抵抗力,而且单一化合物在某种程度下能防治某些害虫和病原生物,因而,对昆虫和疾病的多重抵抗机制才是标准的,植物不主要依赖一种机制,多重抵抗机制的保护效果可达100%。
因此,害虫防治不仅可以通过使用化学药品,而且也可以通过培育抗虫植物。
一、通过遗传工程(重组DNA法)保护作物免受害虫危害
在实际工作中,我们的战略一直是利用通过筛选一种作物属的世界收藏种质而表明的对一种昆虫具有抵抗力的植物材料,然后是了解和利用这一材料对害虫具有抵抗力的基础,特别当抗虫的化合物是一种蛋白质时。如果保护作用是由于在一种植物中存在一种蛋白质,那么就有可能去分离编码这种蛋白质的基因,并通过遗传工程将之转移到已证实不存在天然抵抗力的作物植株中,这种“转化”植物称作转移基因植物,因为这种植物现在含有一个转移基因。植物遗传工程的最新进展已能将一个或几个来源于植物或细菌的“外源”基因转移到某些高等植物中,最初这种方法限制在烟草属和碧冬茄属中使用,但现在其它作物如番茄、马铃薯、油菜、大豆和饲用豆类植物也能被转移基因,这样,转移基因在受体寄主植物中表达,以孟德尔方式遗传,并在后代中表达。到目前为止,有效的基因转移的最有用方法是根瘤土壤杆菌的Ti - 质粒系统,目前这一系统中存在一些适宜的载体,尽管这一技术并不适宜于所有作物。但是,现在的迹象表明大多数双子叶作物在今后几年内会应用于这一方法,并具有足够的对植物育种家有用的效能,这一方法目前不能应用到禾谷类作物中。但是为了同一目的,直接的DNA基因转移被应用到像水稻这样的禾谷类作物中。大菱、高粱、小麦、玉米的最新研究进展表明禾谷类作物顺从于外源基因的稳定转移时间也不会太长了,目前已有大约40个田间试验,大多数是有关茄科中的不同成员,已被用来或正在用来评估转基因植物农学性状在田间的表现情况。来自这些实验的数据,尽管是初步的,但却是鼓舞人心的。现在我们正进入这样一个时期,即对转移基因在作物体中表达水平和位点的精确控制的可能性以及它们在农业上有效性将会得到评价,如果这些被证明是成功的,那么就可以实事求是地宣布这一技术减少了农业操作。
二、CpTi基因——一个研究实例
已经表明胰蛋白酶抑制剂(半热带地区一种重要的食用豆——豇豆种子内自然产生的一种化合物)的水平与这种作物对其主要害虫——四纹豆象的田间抵抗力相关,将纯抑制剂(CpTi)按生理水平混合到人工食物中的实验表明,这种抑制剂能抵抗各种害虫。
豇豆膜蛋白酶抑制剂是一种属于Bowman-Birk型的双头丝氨酸蛋白酶抑制剂的小分子多肽,大约由80个氨基酸组成,在豇豆中,胰蛋白酶抑制剂是由—个小的多基因族产生,并且是利用土壤杆菌Ti - 质粒“双载体”实现基因转移的一些基因中的一种,这种基因被分离、通过标准方法被修饰(遗传工程修饰)以便给出成熟抑制剂蛋白质的最终形式,靠这种标准方法能产生一种新奇的构成物,这一构成物由已知的在植物中工作的新的基因调节顺序,加上成熟蛋白质产物的编码顺序组成,这种构成物被插入一种基于根瘤土壤杆菌诱导肿瘤的Ti - 质粒的双载体,这种土壤细菌通过将一DNA限定片段(T - DNA)从一诱导肿瘤的质粒中转移到伤口感染的细胞核基因组中而引起细菌性根癌病,用于CpTi基因的基因转移载体通过除去引起细菌性根癌病症状的野生型DNA基因,并用现在的CpTi基因,加上另一个基因即新霉素磷酸转移酶基因代替之而使之变得无害,这将使转移植物细胞产生抗卡那霉素的能力,从而允许对他们进行筛选。
已灭菌的烟草叶片(外植体)用含有载体的根瘤土壤杆菌菌株感染,感染期间T-DNA被转移,转移发生后,将外植体转移到含有卡那霉素的再生/选择培养基中,卡那霉素杀死所有未被转移的植物细胞,被转移的外植体细胞分化出茎,然后将分化出的茎自外植体上移去,并转移到诱导生根的培养基中,最终转移到土壤中。
通过这一载体转移的、并携带整合到自身基因组的CpTi基因的转基区烟草属植株表达扣制剂蛋白质,当用棉铃虫属(表1)、天蛾虫属和粘虫属进行抗虫试验时,转基因植株表现出很强的抵抗这害虫的能力。蛋白酶抑制剂在许多植物叶片中能自发产生,并且有时可由于害虫的攻击而被诱导产生,但是到目前为止,还没有直接的证据表明蛋白酶抑制剂在这些情况下可作为保护剂。
在CpTi转基因植株中没有发现显者的表型畸形,他们能开花结果,种子萌发后产生的植株对害虫再次产生抵抗力,在正常情况下,不能直观地分辨出转基因植株和未转基因植株,研究已表明CpTi基因能连续3代稳定地表达,目前正在将之转移到其它作物中,如马铃薯,这些转基因植物的田间试验不久将开始进行。豇豆种子对人类无毒害作用,尽管可被正常烹煮,即使生吃也无毒害作用。
三、其它抗虫基因
利用遗传工程已被转移到高等植物体内并表明是有效的唯一的其它抗虫基因是来自苏云金杆菌的已被修饰的内毒素基因,这一基因最近已成功地转移到烟草和马铃薯体内,与CpTi基因相比,Bt基因的半致死剂量较低,并且每一Bt基因具有较强的寄主专一性,尽管已经鉴定出能抵抗主要昆虫(双翅目、鳞翅目和鞘翅目)中的每一组的不同的Bt基因。当局和公众对使用这两个基因可能也持有不同的观点,因为一个是一种细菌内毒素。另一个是自然产生的植物化合物,通常进入人类的食物中,然而,在这两个例子中,有可能通过利用适当的组织特异性启动子来限制基因表达,主要是作物的非食用部分。
尽管本文的目的不在于评述许多自然发生的、不时地被认为可作为抵抗害虫的保护剂的不同“有毒”化合物,但是,另外,蛋白质功能组还是值得一提,他们是结合糖的蛋白质或凝集素,他们通过粘附到幼虫内脏上皮细胞上而实现其功效,至少就大多数菜豆栽培种的种子中主要的凝集素而论是如此的,这种凝集素 - 植物凝集素(PHA)在由D. 鲍特(D. Boulter)等进行的体外生物测定试验中表现出抵抗四纹豆象和甘蓝象鼻虫的能力,同样豌豆sativum)种子内的凝集素也能有效地抵抗四纹豆象(表2)。
四、转基因植物等基因系的应用
携带不同抗虫因子的相似品种的紧密混合物在农业上偶而被利用,并取得鼓舞人心的结果,即逐步建立感染,但是,以这种方式应用的品种在农学上必须非常相似,因此,携带不同抗虫基因的等基因系会更受欢迎,但是,等基因系一直未被应用,这是因为费用太贵以至不能用传统育种方法产生,现在遗传工程使这成为可能,这一应用设想将携带几个抗虫因子的等基因系在某些情况下合在一个单一的品系中,在其它情况下则处于不同品系中,在生态上这是一种协调方法。不能排除化学药品的审慎应用(综合害虫管理),但是,不同于某些化学方法,这种方法或许不会在生态系统中戳个“大洞”。
五、与化学保护方法相比,具有遗传工程天然抗虫机制的转基因植物的潜在优点
生物测定是通过将豌豆和菜豆纯凝T素制品加到人工昆虫食物中而进行的。由D. Bou Vter和A. M. Gatehouse修饰。
应用具有内源抗虫因子的转基因植物有以下几个可能的优点,这将在不同的作物/害虫情况下产生或大或小的影响。
1.防止害虫随时间的推移而产生抗性:例如,就CpTi而论,抑制剂作用部位是 - 关键消化酶的活性中心,这就留下很少的突变范围而不导致昆虫本身死亡,
2.准确的定时和定位:通过选择适宜的组织和时期的特异性启动子顺序使在一器官中和在所需要的时间内(如害虫攻击时)开始产生保护剂正在迅速变为可能。
3.持久性:虽然只有几个例子,但是转基因植物已表明在遗传上是稳定的,因此,与化学杀虫剂相比,转基因植物的抗虫效果很可能持续时间更长些,而许多化学杀虫剂应用后具有很短的半衰期。
4.对非存心受体损害的有限性:这是极少可能发生的,因为只有“吃”转基因植物的生物才会受影响,不像化学杀虫剂那样,当被喷施后,或许会对生态系统中的其它几种生物有毒害作用。
5.降低了诱导产生次生害虫问题的危险性:应用转基因植物可避免产生这种情况,例如一种化学杀虫剂也能杀死是第一种害虫的捕食性昆虫,因为捕食者吃的是害虫而不是“有毒的”转基因植物。
6.加强环境保护:尽管需要通过仔细控制的田间试验加以肯定,但是,希望将保护剂基因定位在转基因植物中而不被扩散——如不通过花粉等扩散,否则就会像某些化学杀虫剂那样成为环境所不希望的。
六、结语
现在的迹象表明,自然产生的、对昆虫具有抵抗力的、属于不同功能组的蛋白质在植物中广泛存在,他们对有兴趣于通过育种来改良作物的育种家以及有兴趣于通过遗传工程将抗虫能力转移到作物中的生物技术家来说是潜在的丰富的源泉。
[Outlook on Agriculture,1989年第1期]