细菌基因技术利用大肠杆菌作为表达宿主，使之成为产生抗体分子的工厂。由于大肠杆菌易于操作，大大促进了抗原结合穴和抗体骨架的抗体工程。由于大肠杆菌的转化和转染效率高，可进行随机诱变实验和构建文库。由于大肠杆菌生长迅速、易于发酵，可以快速、大规模地生产抗体片段（这也是结构研究的前提），而利用大肠杆菌的代谢特点可以容易地将同位素标记到抗体蛋白上，并且也可以设计代谢筛选方案来筛选结合的和催化的抗体。

我们和贝特（Better）等独立地发展了一种抗体表达系统，既具有抗体在天然状态下表达又具有在大肠杆菌中表达的优点，在天然状态下的表达对于任何筛选都是必要的，因为讲多随机突变体在体外的单独重折叠都较'困难，功能表达也是抗体亲和层析一步纯化法的前提。最后，突变体的不同的重折叠性质可能掩盖了在结构和功能的研究中感兴趣的区域。

一、表达系统

研究的战略方向是将抗体片段的两条链同时分泌到大肠杆菌的胞外质中，这样这两条链可由于相互存在而折叠，并在体内正确装配。氧化胞外质可在每个可变区形成二硫键（这对于分子的稳定是必需的）。已注意到细菌的外膜的渗透性可以变得较大，使胞外质的内容物释放到培养基质中，而与信号顺序的选择无关。但是在较低温度下培养细菌可以避免溶菌，其最终的产率取决于用于表达的是何种抗体片段。

在我们的研究中，所用的抗体是抗磷酸胆碱酶抗体McPC603。对这一抗体已进行了广泛的性质研究，包括测定了它与抗原结合或不结合时的晶体结构。

二、重组抗体片段

通过蛋白水解酶作用很易制备抗体的Fab片段，已完全证实它与完整抗体一样具有相同的结合抗原的亲和力。在大肠杆菌中表达的McPC603 Fab片段也是如此，Fab片段很稳定并且很易结合，因为恒定区是抗体稳定性的原因。但是在大肠杆菌中表达的有功能的McPC603的Fab片段的产率要明显比Fv片段低。用几种诊断性结构变异体来分析这一现象，发现问题并不在于输送和加工，而在子体内的折叠或装配。

Fv片段是可以设计的最小片段，仍然具有完全的抗原结合位点。用蛋白水解酶来制备Fv片段很困难，几平是不可能的，因此在用基因技术制备Fv片段前对它的性质几乎没有什么了解。分析表明Fv片段仍然具有与Fab片段或完整分子相同的抗原结合特性。但是Fv片段具有一种在稀释时解离成V_H和V_L的趋势。精确的平衡常数将随着抗体的不同而变化，因为高变区决定了这一作用。对于McPC603，发现解离常数大约是10^-6M。这个问题并不影响所有的应用，并且相对较小的分子已成为X－射线晶体衍射和核磁共振进行结构研究的有吸引力的靶分子。在肿瘤的诊断和治疗中Fv片段可能具有重要的应用价值，因为较小的分子可以更容易地穿过致密的肿瘤组织，并且抗原性较小。

已经发展了几种策略来克服在维持小分子时的解离问题。首先，这两条链可以用戊二醛共价交联起来，用该法来处理McPC603时，没有丢失何结合亲和力。其次，可以形成分子间的二硫键。已经发现在胞外质中同时形成了额外的二硫键，因此这种分子可以在大肠杆菌表达的有全部功能的形式中获得，抗原结合亲和力几乎不受影响。第三，这两个结构域可以通过连接肽来连接，以前作为不溶性内含物已经获得了这种单链的Fv片段，在体外必需重折叠。这种单链的Fv片段也可以有功能的形式分泌，几乎不改变其结合亲和力，与分泌Fv片段相比，以单链形式分泌的片段的结构域连接起来并不明显地影响功能片段的产率，因此在大肠杆菌中V_L和V_H的结合不可能是一个动力学难题，这两个结构域的连接是可以任意选择的而不是必要的。尚不清楚连接是否会抑制在McPC603中没有的其它抗原结合位点。

对游离的V_H和V_L结构域的性质也进行了研究。同样它们的性质将随着所用的抗体而变化。没有发现McPC603的V_H有结合抗原的作用，但发现在高于4°C时溶解度较小。因此把V_H结构域作为抗原结合位点的一般取代物仍然具有技术上的困难，即使是通过结构工程解决了溶解度的问题，但仍然不能肯定能否在这种多饰的片段中保留满意的结合能力，特别是狭隘的专一性。

另一方面，V_L具有一种自我形成二聚体的倾向。精确的解离常数同样随抗体的不同而变化，但通常在10^-3—10^-6M之间。McPC603的V_L也不结合抗原，但这一重组的结构域能形成排列很好的二聚体的晶体。这为迅速获得特征性的互补决定区的结构数据提供了令人鼓舞的前景。

三、文库

抗体文库的表达是特定抗体种类表达的延伸。PCR技术的出现提供了一种快速扩增抗体基因的方法，因为这些基因在可变区、骨架区和恒定区基因的5’和3’端均具有保守序列。用入噬菌体构建文库的一种方法是，从免疫的动物中提取抗体重链和轻链的mRNA，分别经PCR扩增，再将扩增产物重组起来，在重组噬菌体中按以前描述的在表达载体中那样精确排列。虽然噬菌体可能不是较好的生产载体，但可以通过标记抗原的“反向”免疫筛选来选择有结合能力的Fab片段。

对于大的抗体文库来说，真正的困难是筛选。虽然常规的筛选技术对于较小的文库是有用的，例如来源于免疫动物的高度富集的mRNA，但是要在所有设计的抗体（即非免疫动物）中筛选出具有高度亲和力和狭隘专一性的能结合的片段实际上是难以做到的。因此，用大肠杆菌取代单克隆抗体技术可能主要取决于发展筛选和富集免疫系统要用有效多步过程方能达到的狭隘的结合专一性的系统。

人抗体是这一技术十分明显的目标之一。这种人抗体片段明显她减少了在抗体临床使用中出现的抗原性问题，但是仍有其它的障碍。如果用大肠杆菌筛选不能选择出具有高度亲和力和高度专一性的抗体，那么由于与体内其它组织发生交叉反应的问题可能导致严重的临床后果，特别是当给予大剂量和低亲和力抗体时更是如此。因此抗体研究仍然，面临着许多挑战。

[Nature，1990年10月4日]