现在已经可以用遗传工程的方法制造单克隆抗体，并赋予它们以新的性质。将来可以通过开发免疫动物的可变区域基因的组分用基因技术产生抗原结合碎片，并表达在细菌里。那么将这一方法推广到可变区域基因的体外组分的生产以及避免动物免疫是容易的吗？

1975年一种根据所需的抗原特异性分泌单克隆抗体的细胞系的生产方法问世了。这一“杂交瘤”技术具有普遍意义，现已制得许多单克隆抗体，它们能与蛋白质、碳水化合物、核酸以及半抗原相结合，甚至还具有催化活性。这一技术产生了许多对科学研究、人类健康有实用价值的运用。在过去几年中利用预选抗原结合的B细胞和筛选抗原覆盖的过滤器，已经改进了这一技术。

杂交瘤技术最初是由于体细胞遗传学而得以发展起来的，也就是让抗体突变而加以选择，通过关闭重链稳定区域来改变其功能性质。使抗体具有双重特异性质。因为目前抗体基因可能改变其顺序，基因技术已经革新了抗体未来的功能。最初抗体基因'是从杂交瘤中获得的，并在质粒传播媒介中得以无性繁殖，以完整的抗体形式表达在哺乳动物细胞中，或以碎片形式表达在细胞之中。通过剪辑和传递限制碎片，或定位诱变，已经可以形成新的抗体试剂并精细地描绘抗体的结构功能的关系。

最近提出一种不用杂交瘤的新方法，直接从免疫动物的淋巴细胞中无性繁殖抗体基因，并把它们表达在细菌中，为了与抗原结合将抗体产物进行筛选。与杂交瘤技术相似的是，这种新技术需依赖于动物免疫而释放出许多专门针对某种抗原的细胞。在动物身上，首先是低亲合性的抗体通过细胞的抗原诱导增殖而产生，随后通过点突变和选择产生高亲合性变体，杂交瘤技术可以使这种细胞不断生长，而基因技术则可以不断繁殖基因。然而，在这两种情况中，都是靠动物在产生新的分子。

将来，我们能不用动物就获得新抗体吗？当代指令学说论者在运用计算机绘图技术建立特异的抗原结合部位。在此我们将阐明某些具有实用价值的并且已经生产出一些设计出来的抗体的操作方法，并对改进它们其他性质的可能性加以探讨。

从杂交瘤开始

抗体（Ig G）是一种Y状的分子，在其双臂末梢形成的区域与抗原结合，而在主干部形成的区域则与发挥其基因效应功能有关。这种结构使得分子特别易于被蛋白质工程处理，因为具有抗原结合活性（F_v、F_ab片断）甙基因效应功能的功能区域可被分裂成碎片或作抗体之间的交换。此外，抗原结合环包围着的可变区域的刚性β型薄片结构可以使结合点从一个抗体转移到另一个抗体身上去。这些结构上的特点，可产生一系列的抗体，这是从具有通过自然效应物系统摧毁病原体或肿瘤细胞能力的完整抗体到抗原结合碎片（它们能被用作攻击有毒物质或有被束缚的放射性同位素存在的诊断）。

抗体是通过在细胞表面发射补联级簇射，然后引起细胞溶解，或者在诸如吞噬细胞或K细胞的特征化的效应物细胞表面与受体结合，并发出吞噬细胞或与之有关的细胞溶解来杀伤细胞，细胞溶解的潜力主要决定于稳定区域的种类。这是通过制备嵌合抗体而被分割开来的，在这抗体中啮齿动物抗体的可变区域是与人的γ同型抗体的稳定区域相关联的，人的γ1同型抗体无论是在正常血清情况中还是在与细胞有关的杀伤中都是极有效的，因此最适合于治疗病原体或肿瘤细胞。与之相反，不太活泼的人γ4同型抗体可能更适合于诊断图像或锁住有毁坏作用的免疫，或者与抗原结合引起的过敏反应，从而对抗破坏性的抗体。对个别的氨基酸残渣作用进行分析就可能用工程方法产生具有不同效应物作用系统的单个抗体同位素变体。这样，具有高亲合性的受体（FcRI）的结合点就包含了抗体较低的绞合部位。补体的前一个成分结合部位核心就是后者重链稳定区域（CH₂）的β薄片的绞合。

虽然有些啮齿动物（特别是鼠γ2a和兔γ2b同型）抗体能发挥人的效应物作用，它们在人治疗中是致免疫的。鉴于直接制造人单克隆抗体的困难，可以把啮齿动物的可变区域和人的稳定区域结合使啮齿动物具有“人的形态”（嵌合抗体）、这减少了抗体在临床试验中表现出来的免疫发生性，但是由于外来的V区域结构的优点，仍有残余的免疫发生性被保留下来了。

有一种使啮齿动物具有人的形态的较为完善的方法就是替代V区域结构，这方法是依靠作为覆盖抗原结合环的β薄片的框架的V区域的组织结构，通过移植这些环，抗原结合部位就能从啮齿动物上转移到人抗体上去。这一技术被用以使直接治疗人白血球的鼠治疗抗体具有人的形态，这项技术在临床上成功地治疗了两名肿瘤病人。但是重新赋形要求将不同的结构区域的构造都保存下来，即包括每一区域的两个β薄片的取向和重链可变区域V_H和轻链可变区域V_c同时封装这两个方面。超可变环造成了与抗原的大多数的结合，而这些环是为其下的β薄片框架以同样的方式支持着的。简单的分子模仿能有助于鉴别接触和对完美的亲合性设计上的微小改变。

虽然自然效应物功能是强有力的，但是抗体也能用工程方法补充其他效应物的功能、例如通过产生抗体的方法。这种抗体的抗原结合部位对一个靶细胞来说具有双重特异性，以及像毒素那样的效应物。这种杂交的“杂交瘤”技术是利用融合两种不同的特异性的杂交瘤而制得的。一个抗体分子的两半的每一部分都是来自两个亲代抗体之一，因而分子具有两种不同的抗原结合部位。这种有双重特异性的抗体既能与一个细胞靶（如肿瘤之中的）又能与某种毒素或者有细胞毒性的T细胞相结合。将含有抗原结合部位编码的基因片断和有毒素和酶编码的基因融合起来就可获得新的效应基因功能。例如，可以通过与纤维蛋白结合的F_ab、作为凝血块的目标靶，这就导致纤维蛋白溶酶原只能在规定地点激活。抗体F_c断片能用抗体效应物功能来武装其他蛋白质。例如，与F_c断片结合的CD₄在感染了人类免疫缺乏病毒（HIV）的细胞表面与病毒糖蛋白（gp120）结合，并利用与抗体相关的细胞溶解杀死这些细胞。

完整抗体是大分子（相对分子质量为Mr150K），但小得多的断片却能被制备且保留抗原结合活性。用放射性同位素处理过的小断片（Mr12K~15K）能用于图像形成、治疗等，因为它们能有效地穿透组织边缘，所以用于体内特别有吸引力。断片也能较快地从血浆和组织中被清除，虽然作为以药剂为目标的用途，其作用可能被减弱。它们能帮助清除如狄戈辛（digoxin）的有毒药物。对基础研究，小断片也颇具优点，如对抗原结合部位的高分辨力的X射线结晶学的研究。抗体大小和F_ab臂和F_c区域的绞合联接的可塑性促使晶体学家转向了F_ab断片乃至目前的F_v断片的研究。由于抗体的断片易于被表达在引入哺乳动物或细菌细胞的基因的活泼形式中去，所以在未来，断片可望得到广泛运用，但抗体断片则需要未来的工程方法能消除不需要的性质。

例如F_v碎片是将分离的V_H和V_L区域的杂二聚物以非共价形式联接起来的。虽然某些F_v碎片比起其他的更不易被分离。稳定的F_v碎片可通过将亲水的可变的肽把这些区域联系起来制造出单链F_v断片（SCF_v）的工程方法制备，亦可通过引进区域之间的二硫化物键的工程方法制取。具有抗原结合活性的单V_H宿主（dAb）似乎需要有更多的工程制造方法。这宿主具有暴露的防水表面（它们通常在此与轻链相接触），这使它们更有“粘附性”。如果它们的性质得以改进（例如向界面引进亲水性残渣），这些单一宿主可能就是新一代的小型鉴别分子的前兆。

避开杂交瘤这一环节

免疫对于获得能分泌高亲合性的抗原是必要的，在动物身上，这些抗原形成分为两个阶段。第一阶段是快速的，并产生具有低亲合性（10⁵~10⁷M^-1）的抗体，它包括免疫获得时间内，已经有效的组分的细胞的增殖。而尚未有效的组分是巨大的（＞10¹⁰），但在任一特定时间，只有一部分鼠的尚未有效组分会在有限的表达抗体的克隆（10⁷~10⁸）中是有效的。

第二阶段则产生高亲合性抗体，它始于前一阶段。其主要工具就是根据由于产生亲合性递增的抗体的细胞选择而获得的这些基因的高度突变。这是一个进化过程，它包括生存细胞的抗原所要求的选择而产生的点基因突变的变化。这又是一个遗传过程，但只是处于个体淋巴细胞的体水平上。由此而产生的记忆细胞似乎能经历一个新的由抗原所致的高度免疫和选择。

根据最近估计，每个细胞组的每一基对的突变率达到了10^-3或3×10^-4个突变。突变是局限在将抗体基因的可变部分编码的片断的指定部位的。由于高度基因突变而产生的多样性简直是天文数字。即使只有一个抗体的可变区域的高度可变区可以突变为20种氨基酸中的10种，就足以产生对每个链来说约10³⁰个变体。因此在这一阶段主要问题不是多样性，而是对改善退化背景的连续性选择。随着免疫，高亲合性抗体会伴随在原始组分中罕见的V-D-J组合而逐渐出现。

在“典型的”抗体工程中，具有已知的专一性的杂交瘤提供了无性繁殖重新排列的抗体V_H和V_L基因的原材料。运用一般引物和聚合酶链反应（PCR），就可以在这些引物中建立限制部位，直接克隆放大的DNA，以便表达在哺乳动物细胞或细菌里。

这就为细胞系产生单克隆抗体衍生物提供了一条新路，说得最简单，就是可以使V基因从不稳定的杂交瘤融合（如人－鼠杂交瘤）、单杂交瘤细胞，甚至单B淋巴细胞中脱离出来，杂交瘤的优点是因为融合能丰富抗原刺激细胞。然而由单B淋巴细胞产生的V基因脱出是避开了细胞融合，最终能区别出有丰富信使RNA但不能融合的B细胞。单杂交瘤或B细胞亦可能通过结合抗原（固定在诸如极板或磁泡等固态支持物上的），或者利用荧光激活细胞分类（FACS），或是运用覆盖了抗原的红细胞而被分离出来。那么个别细胞中的单V基因族就能表达在细菌中。但是在这种情况中，每个细胞必须被分别处理。

不均一的细胞群的无性繁殖具有一种优点：即所有的细胞都可以一起加以处理。例如从一只免疫鼠的未分裂的完整细胞中取得的V_H和V_L基因就是随机地与经过抗原结合活性筛选的X噬菌体表达出来的F_ab断片相结合的，其缺点在于原先为获得高亲合性而通过免疫选出来的V_H和V_L配对消失了。一个只有当一千种V_H和一千种V_L基因被等同表达出来的组合基因文库对于10⁶到5×10⁶个克隆之间的筛选以覆盖大多数原始配对来说是很必要的。因此一只免疫鼠的较大的随机组合文库的原始V基因配对的覆盖几率是很低的，甚至于对高度免疫动物的具最高亲合性的抗体亦是很遥远的。具有与抗原结合能力的V_H和V_L区域配对似乎是以较低的亲合性或者是以比抗原选择过的较低的专一性来起作用的。虽然已有报道说具有良好亲合性的抗不全抗原F_ab断片就是使用上述方法的。而这一方法目的就是不要使用杂交瘤。为了诊断和治疗的目的有必要制取高亲合性的抗体，而抗体是难以从杂交瘤获得的。

为了改善原始配对再次被覆盖的机会，可以用很小的抗原选择B淋巴细胞群来减少组合文库的复杂性。但是一切组合手段将极大地取决于有效的筛选方法，用于筛选大量克隆的薄膜滤器是大有发展前途的。现已开发出多种形式的模式：如复以抗原的过滤器上的抗体俘获、采用抗球蛋白剂的检测等等。无论采用哪一种方法，就可以使抗体或F_ab断片直接在薄膜滤器上，或间接地通过抗球蛋白剂被固定下来，并用标记抗原加以探测。

能绕过动物这一环吗？

展望未来，有可能采用抗原结合环折迭在结构性框架上的优点来形成抗体。一般说来这些环具有有限的构造数，它们可以通过有选择的结合或形形色色的侧链而产生无穷尽的结合部位。最近，按模板制造抗原结合部位的成功预言了重新设计的良好前景。这一方法可能对于制造催化抗体——尤其是对于那些很小的基质——来说是很有吸引力的。这儿有可能引入侧链或弥补基的结合部位，不仅是有选择性地与基质的过渡态相结合，而且直接参与键的形成和断裂，唯一的问题就在于专门为了结合的抗体结构是否是产生催化剂的最佳起点呢。像TIM这样的纯净的酶构形可能较为合适，TIM酶也可以像抗体一样具有一种绞合的筒状和α螺旋线的框架结构和与基质相结合的环，许多具有多种多样催化性质的酶就是依据这种结构和环而形成的，这种结构和环因其具有新的催化和结合性质的设计而能被独立地处理。

我们能否建立一个人造的选择系统（例如是利用细菌或噬菌体）替代“设计和建筑”的方法来选择抗原结合活性呢？这无需任何抗原的结构信息。但是我们看不出来有什么可以一次成功地选择高亲合性的结合活性的办法；倒是可使低亲合性可以发展成高亲合性的免疫系统更实在一些。那么是否可以模仿这一系统的策略并真正加以改进呢？

首要的任务是要准备抗体基因的啮齿组分。最简单的办法就是采用聚合酶链（PCR）方法和普通引物在体外复制啮齿动物的重新排列的V基因组分。然而“啮齿动物”并非真正的啮齿，而有用的组分则是在大小形态上都受到自身表位的限制。从原理上说，可利用编入细菌株V. D. J基本组成部分的限制性碎片之间的任意组合按照哺乳动物的办法那样构成很大的组分。为了与动物未分化的组分相匹配，我们还必须复制由重复组合而创造的接合与的多样性，而大的组分亦可能利用模仿鸟的基因转换过程来制造。

然而这种“天然”组分并不理想。细菌系V基因序列以及与基因组中V基因高度相关的多样性本身就是进化的压力和机遇的结果。这种组分既是有明显倾向性的又是高度过剩的。利用各种动物源的V基因（包括与V基因和甚至是全新的V基因或D碎片设计极其相关）可能构成更有效的组分。譬如，个别抗体环的结构通常是与其所有折迭十分相似的，而且可以用各种侧链来喂养。

下一个阶段就是要将组合库表达出来，并利用V_H和V_L区域的任意组合来筛选抗原结合活性。理想情况应是“完整的”、即包含对任何可接受的表位都有最小结合亲合性的抗体，原始抗体结合得越紧，所需的组合文库就越大。据现有估计，一个含有10⁷个不同抗体的原始组分要比99%的具有10⁵M^-1或更好的亲合性常数表位更容易鉴别，它仅对随机取样的表位（＞10⁹M^-1）的高亲合性抗体有影响。如果一个人造的组合库的数百万V_H和V_L组合能被筛选的话（如用亲合性减小到至少为10⁴M^-1的膜滤器），那么这组合库就会和一只鼠的（10⁷抗体族）原始组分同样完整。将来大型组合文库的筛选会很好地为选择方法所代替。例如通过在噬菌体表面表达功能抗体断片，就能利用与抗原结合而大大丰富想要的V基因组合。假如这些筛选和选择技术能像在动物身上一样地发挥作用的话，我们就可以模仿原始反应而大量获得低亲合性抗体。

通过点突变或多处突变，可致体内亲合性的增强。在体外模拟对应低亲合性抗体的基因高度突变是很容易的。点突变可以利用多种技术引入V基因，例如有错误倾向的聚合酶，贯穿大量循环的聚合酶链（PCR）放大有提高核苷酸三磷酸盐的比率或者增强缺乏核苷酸引物的倾向。多重突变可以同时是整个基因体或每个高度可变的环的靶目标。

改善亲合性的突变的筛选或选择似乎更困难，因为要对亲合性略有差异的突变加以区分，这种区分对琼脂糖中的杂交瘤克隆则是可能的，它是通过与不同抗原密度覆盖的膜上分泌的抗体相结合而实现的。利用与低亲合性抗体竞争有可能获得不同的与抗原覆盖膜的结合。然而我们提出的这一系统是与动物的原始比较。更理想些，我们宁可选择细胞内高度突变的特殊DNA碎片，而不是孤立的DNA之内。并同时将这些产物表达在细胞表面，以进化的方式选择亲合性稳步提高的变体。动物对完成这项工作是极为合适的，这是因为它们极其有效的方式使工作易于进行。我们可能学会动物的策略，同时在利用汲取免疫动物的高度突变的V基因而产生高亲合性抗体技巧这一点上往往能更成功些。

人类抗体的今天和未来

制造人单克隆抗体的要求已经向杂交瘤技术提出了难题，譬如，作为人细胞融合参与者的鼠骨髓瘤的使用会造成人染色体的首先丧失以及杂交的过分的不稳定性，杂交瘤是来自脾脏或淋巴结的，然而源于人的原始资源——末梢的血淋巴细胞——却只含有很少几个胚细胞活跃在免疫反应之中。作为融合的一种相反的替代，Epstein-Barr病毒引起的人细胞的长期繁殖不会导致抗体反应中的胚优先永久繁殖。将来，人类能很好地对尤其是有毒化合物，病原体病毒或癌症细胞等疾病高度免疫。在任何情况下，将人抗体从人细胞表面抗原分隔必须克服通过自身反应而清除淋巴细胞的耐受性机制。人淋巴细胞近来被用于普通的严重结合免疫缺乏鼠，这些动物能获得免疫以制造人抗体。

基因技术提供替代物，赋予啮齿动物的单克隆抗体以“人的形态”，是近来最有实用价值的方法。这使我们能获取具有良好的亲合性和特异性的啮齿动物抗体的巨大基因文库，尤其是涉及治疗肿瘤的抗体和在人免疫系统内部的操作时，这方法显示重大的优点。人们已经制得数以千计的抗体来对付人细胞表面抗原、特别是对付人白血球，只要移植人抗体的抗原结合环，就可以给这些抗体重新赋形，从而获得能够像真正的人抗体一样具有免疫遗传性的“人”抗体。未来，将有好几种上述的其他方法对基因技术产生效果。不仅如此，已经获得携有免疫球蛋白V. D. J和人类C区域的移植基因鼠，这样就可以直接从高度免疫鼠身上获得人抗体，仍有待观察的是受移植基因动物的新DNA数量限制的组分的大小是否会缩小。

然而，这所有的方法都得与Epstein-Barr病毒和细胞融合的永久化相竞争，它们本身就是不断在改进的，尤其是这些方法就是始于包括DNA操作的思想与技术的混合。有些免疫反应对人来说是唯一的，或者说它们需要被赋予人的特征，这包括那些自身免疫、寄生性疾病、传染性疾病或癌症等。借助人杂交瘤或是Epstein-Barr病毒固化的细胞系的帮助可以获得赋予这种抗体以一定特性并使之长期繁殖的强有力的方法。

正如埃里希（Ehrich）在90年前写的，“……我们希望之曙光已经展现在眼前，不仅如此我们还期望在生物学和治疗学上获取丰硕的宝藏。”我们面对的是一片新旧交错的技术之林，在不久的将来，这大部分技术都可以从免疫动物身上开始。

[Nature，1991年1月24日]

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注：两位作者均在剑桥英国医学研究委员会分子生物实验室工作。1975年C. Milstein与G. K?hler一起发明用老鼠产生特异抗体的方法。（并因此而获得1984年度诺贝尔医学生理学奖）。G. Winter则于80年代中期发现与抗原相联接的环状结构的部位。