构建能转化烟草和油菜并得以表达的嵌合核糖核酸酶基因，这种基因在花药中的表达能有选择地破坏包围花粉囊的毡绒层细胞，从而阻止了花粉形成而导致雄性不育。这些核雄性不育基因的表达应有助于获得更多各类作物的杂交种子。

显花植物的雄性生殖过程发生在花药中。花药由几种类型的组织和细胞组成，其中包含着数千种为花药所特有的mRNA。花药的功能为产生具精细胞的花粉粒，毡绒层是花药的一种特殊组织，在花粉形成中起重要作用。毡绒层在花药发育的早期围绕着花粉囊，后随花药的发育而消失，花药成熟时已不复存在。毡绒层能产生几种有助于花粉发育或者构成花粉外壁的蛋白质等物质。

经验证，细胞质和细胞核的突变能阻滞花粉的正常发育而导致雄性不育，而这一过程恰恰是由干扰毡绒层细胞的分化和功能的行使引起的。这就说明毡绒层对形成具生理功能的花粉粒是必需的。现已证实，致雄性不育的突变对于制备高产作物的杂种是很有利的，但若以生产角度而言，杂种的制种尚有一定的局限性，只有那些事先经鉴定知道它们的雄性不育能被恢复到可育的品系或那些可用机械方法从花中分离出花药的品系才能被利用。假如我们能用基因工程技术将一种显性的雄性不育基因导入各类作物，这些作物产生杂交种的可能性就会大大提高。

这里报道的是烟草的一个毡绒层特异性表达基因的5'端核苷酸片段，它具有激活被转入烟草和油菜植株毡绒层细胞的葡糖苷酸酶（GUS）标记基因和两种不同的核糖核酸酶基因表达的功能。转入的嵌合的核糖核酸酶基因表达在花药发育过程中能选择性地破坏毡绒层，从而使花粉不能正常形成而造成雄性不育。

烟草花药毡绒层基因的表达

我们曾叙述过烟草花药的两种互补DNA克隆即TA29和TA13的鉴定过程。这两种DNA克隆在核苷酸水平上有85%相似，且具有与1.1和1.2 Kb花药mRNAs互补的功能，而这些花药mRNAs在其他花器和营养器官系统中是不能检测到的。花药切片的原位杂交结果表明：TA29与TA13的mRNAs均位于毡绒层细胞内。

对DNA研究指出，在烟草基因组中，类似TA-29与TA-13基因不到5个，而这类基因存在于其它许多植物中，如番茄、油菜、莴苣和苜蓿。我们用TA29 cDNA从烟草基因文库中筛选得到并分离出了一个含TA29基因的克隆，对其进行DNA序列分析，发现它无内含子，能在有潜在糖基化部位编码一段相对分子量为33 K并富含甘氨酸（20%）的蛋白质。总之，我们从实验中得到的结论是：TA29基因存在于许多种远缘植物中，它仅在花药毡绒层细胞中特异性表达，它编码一种性质类似于某些植物细胞壁蛋白的蛋白质。

毡绒层基因特异性表达的调控

对离体花药和叶片细胞核中合成RNAs的转录阶段的研究表明：TA29基因的调控主要发生在转录水平上。为了阐明5'端顺序调控TA29基因表达的特征，我们将大肠杆菌的GUS基因和一个具起始密码子的1.5 Kb TA29基因上游片段（核苷酸-1477→+51）相嵌合，构建成一个TA29-GUS基因，再把它导入到烟草植株中。我们成功地转化了13株，每个转化子所含非重排的TA29-GUS基因的拷贝数有1~3个不等。尽管有此差别，每个转化子都获得了GUS mRNA与酶活力，说明嵌合TA29-GUS基因已受正确的调控。为了确定TA29-GUS基因的器官专一性表达，我们把一个GUS基因探针与从转化子N102-2提取出来的各种不同的mRNAs进行杂交，得到了GUS基因在N102-2转化子中的表达水平与我们所有转化子表达的平均水平接近的结论。GUS-mRNA仅在花药中出现，在其他器官系统中都检测不出。对不同发育阶段的花药考查GUS mRNA及酶活力情况可发现，它们与内源mRNA水平波动有关，并随毡绒层细胞的出现或消失而同步上升或下降。

为比较TA29-GUS基因与内源基因TA29的细胞特异性表达方式，我们分别用TA29和GUS反义-mRNA探针与N-102受体花药的连续切片作原位杂交。用GUS反义-mRNA去杂交的：第二阶段毡绒层中，密集银粒子显示杂交现象非常明显。相形之下，在第八阶段毡绒层已解体后，就看不到杂交粒子了。用TA29反义-mRNA去杂交的，其方式与前者相同，GUS酶的活力在第二阶段可测得，在花药其它组织中就测不到了。上述种种情况表明：TA-29基因5'端1.5 Kb片段包含所有调控毡绒层特异性基因表达的信息。嵌合TA29-GUS基因与内源TA29基因受到相同的调控。

TA29-RNase基因导致雄性不育

用化学合成的，编码RNase-T1的米曲霉Aspergillus Oryzae基因（RNA酶基因）和从Bacillus amyloliquefaciens中提取的天然的RNA酶基因（称为barnase基因）分别与1.5 Kb的TA29基因调节片段相嵌合，嵌合基因的表达就在花药发育中去选择性地破坏毡绒层细胞系。我们把两种嵌合TA29-RNase基因分别导入了未转化过的或已含TA29-GUS基因（N102-2转化子）的植株中。

我们共得20个TA29-RNase T1和115个TA29-barnase的转化子。60%的这些转化子中含单拷贝TA29-RNase基因，其余的按实得转化子的不同分别并列嵌入了2—6拷贝的TA29-RNase基因。就生长率、长度、营养器官和花器的形态、花期、花色等而言，TA29-RNase T1和TA29-RNase转化子，转化子与未转化的对照植株基本相同。但是，有10%的TA29-RNaee T1转化子（2/20）和92%的TA29-barnase转化子（106/115）未能产生花粉。与未转化植株的成熟花药相比，转化子的花药皱缩，色泽棕灰，无花粉粒。

无花粉的TA29-RNase的植株是不能结出蒴果与产生种籽，花很快枯萎凋谢。但这种植株用未转化植株的花粉异花授粉后，就能结果结籽了。这表明：无花粉的TA29-RNase植株是雄性不育的，但它们的雌蕊仍能正常识别和接受花粉，亦即它们的雌性生殖能力未受影响。嵌合单拷贝TA29-RNase的转化子在异花授粉后产生的后代中，雄性不育与雄性可育植株的分离比为1：1，且这两种表型的出现与否直接取决于嵌合TA29-RNase基因的有无。由此，可以得出结论：任何一个嵌合TA29-RNase T1基因或嵌合TA29-barnase基因都能导致雄性不育的烟草植株的产生。

从TA29-RNase T1雄性不育植株的花药中鉴定出RNase T1和TA29 mRNAs是同时存在的。又对含TA29-RNase T1和TA29-GUS基因的雄性不育N102-2转化子的花药检测到并分析了Gus酶的活力情况。用TA29-RXmRNA探针与第二阶段的花药切片作原位杂交后，只得到一些残余的内源TA29-mRNA，这一结果与从含TA29-GUS基因花粉得到的毡绒层特有的强化转录信号形成对照。连续切片与RNase T1反义-mRNA探针杂交未能显出表杂交点子的存在。RNA点杂交表明：RNase T1反义mRNA可出现在雄性不育的花药中但只在未转化植株的TA29-mRNA峰值出现前的一段时期内可现（即第1阶段相对于第3阶段）。此外，在仅含TA29-GUS基因的花药中，RNase T1 mRNA的量比TA29 mRNA或GUS mRNA都低100倍，而含TA29-RNase与TA29-GUS基因的雄性不育花粉内GUS酶活力与N102-2转化子花药的毡绒层特有的高GUS酶活力相比，已小到测不出了。所以说：雄性不育的表型的出现与毡绒层特殊mRNA水平的明显下跌有关，而此下跌又与嵌合TA29-RNase基因的存在相联系。

雄性不育的花药不产生花粉

在106株有嵌合TA29-barnase基因的雄性不育植株中未发现花粉粒的产生。但在含TA29-RNase T1基因的烟草雄性不育的裂开的花药中，我们得到了少量类花粉的结构。这种类花粉结构有的不能继续正常发育，有的会产生不正常的花粉管，因而，它们都不能使雄性可育或不育的雌蕊授粉，且它们的数量比雄性可育花药中产生的花粉粒少100倍。我们在扫描电子显微镜下看到了类似花粉结构。这些异常花粉比正常烟草花粉粒小约50倍。对异常花粉高倍放大观察发现：它们的花粉外壁异常，缺少花粉沟或花粉槽。由此，我们认为：嵌合TA29-RNase T1基因或嵌合TA-barnase基因的表达选择性地破坏了毡绒层而阻止了花粉粒的发育。

TA29-RNase基因在其他植物中的表达

我们还用嵌合TA29-RNase T1和TA29-barnase基因去转化油菜植株，以便了解烟草TA29基因5'端调节区段能否在远缘植物中也可行使同样的功能。

使转化子成为雄性不育植株。实验中，我们得到了含1个或2个完整的有关TA29-RNase基因的转化植株。其中24株含TA29-RNase T1，13株含TA29-barnase。随TA-RNase基因分离而分离出的雄性不育表型在TA29-RNase T1转化子中占71%（17/24），在TA29-barnase转化子中占77%（10/13）。转化株雄性不育的花与未转化株雄性可育的花相比，不育的花瓣稍小，雄蕊不伸出花瓣，花药裂开时也无花粉粒散出。在其它各方面，两种花完全相同。甚至，雄性不育的花也有发育良好的蜜腺。

我们观察了雄性不育的油菜在5 mm长未成熟花芽阶段的花药解剖结果。雄注可育油菜花药的照片显示了花粉囊内发育中的花粉粒和囊外围绕着它的完整的毡绒层。对比之，含嵌合TA29-RNase基因的雄性不育的油菜花药中无毡绒层，花粉囊形状不规则，也无可见的小孢子或花粉粒。另外，从27个裂开的雄性不育花药中得到的稀少的2个类花粉结构的扫描电子显微镜照片中可见这种结构与一粒正常的油菜花粉粒相比：大小异常，缺少规则壁外结构。上述实验结果表明：烟草TA29基因的5'区段在油菜花药中能够行使功能，TA29-RNase基因的表达选择性地破坏了毡绒层，毡绒层的消失就导致了雄性不育油菜植株的产生。

本文中的各实验表明：TA29基因5'区段能专一地在花药毡绒层细胞中调控GUS，RNase T1和Barnase基因的表达。TA29基因主要在转录水平上受调控。

含嵌合TA29-RNase基因的植株的表型有利地支持了我们的观点：TA29基因在烟草和油菜植株的毡绒层中都能强烈地表达。假如这个基因在生活史中的其它阶段表达，则将会干扰正常的培养生长和花系发育。TA29-RNase基因的表达破坏了毡绒层，但不明显地干扰花药发育。这说明毡绒层细胞系的消失不影响花药的继续发育，也就是说，毡绒层细胞能自发地行使功能。在花药发育的后期，细胞的分化或行使功能无需毡绒层细胞的存在。

TA29-RNase T1和TA29-barnase基因中任一基因的表达都能诱导产生雄性不育植株。这些雄性不育植株除不能形成有功能的花粉外，其余各方面均正常。毡绒层对花粉的正常发育是很必要的，两种类型的RNase基因的表达可能通过水解毡绒层细胞的RNA途径来选择地破坏毡绒层。

TA29-RNase基因能诱导雄性不育植株产生的结论为杂交作物的生产提供了一个新的战略。把这种显性致雄性不育的基因转入小麦等作物中，就可避免用机械的方式移取花药来产生杂种植株。把嵌合TA29-RNase基因与一种除草剂的显性基因偶联，就能设计出自发选择雄性不育植株群体的育种方案。

[Nature，]990年10月25日]