多年来,人们一直在寻找一项有效技术用于提高生物制品和细胞培养物贮藏时的稳定性。随着生物技术产业的发展,对这项技术的需求越来越迫切。特别对于那些对冷冻特别敏感的不稳定产品,高度纯化的化合物和工程细胞系。到目前为止,常规使用的技术包括冷冻(-80°C)和冷冻干燥。而对于蛋白、质,常采用盐析制成稳定的晶体后再低温贮藏。尽管这些技术在特定的运用中确有其优点,但明显存在缺陷:高成本:冷冻干燥时经常的低温率:盐析和冷冻时常需符加高浓度的盐类或细胞阻抗剂,而在使用前,这些添加成分又必须去除。现在,一项更有效的贮藏技术——过冷技术已出现。这项技术使用简单并且克服了其它技术的主要缺点。
生物劣变
所有具有功能的生物材料当从自然的环境中分离出来后日趋降解并失去活性。这是因为在分离和纯化时环境条件发生变化而生物材料本身只能在一个狭窄的环境条件范围内具有稳定性。细胞培养物在一定程度上对环境条件具有忍性,但若未保存好也会劣变并逐渐死亡。尽管这种正确的劣变机制尚不清楚。但任何探索具有更好的稳定性和贮藏特点的工作必须瞄准减缓代谢,保持可接受的环境条件直到材料处在一个稳定的、代谢不活跃状态。
过冷原理
过冷技术吸收了低温的优点,摒弃了冷冻的缺陷。在某种条件下,当温度下降至冰点以下时,水并不结冰。在桶装水中,因为存在特殊的不溶物质(例如,尘粒),而这些物质又和冰晶核具有相似的物理性质(如体积)。因此当温度在0℃以下时,这些物质催化冰晶核的形成,结冰便开始。但是当桶装水或水相分成小液滴,并加入对冰晶核无催化作用的惰性非水相媒介物使小液滴分散分布时,就可阻止或延缓这种异质冰晶核的形成。当然,任何含有尘粒的小液滴在降温时仍发生结冰,但大部分水滴在这种媒介物中不结冰,不受温度的影响。利用这种方法,纯水可过冷-40°C。当然进一步降温时,发生结冰的可能性不可避免。水溶物和悬浮液同样能按过冷的方法处理,但过冷的变化范围与水相中冰晶核形成的催化位点的效力相关。例如,在发生结冰以前,红细胞能过冷至-38°C;微生物悬浮液可降至-25°C。
过冷技术操作
水相和媒介相的相互渗透可通过机械方法,并根据不稳定材料的脆裂程度选择适宜的方法。过冷的范围不仅依赖于水相或悬浮相本身,而且依赖于液滴的体积和分散相干的分布。因而,尽可能获得对材料无损伤的均匀一致的悬浮液,这是非常重要的。简单的混合装置例如同轴圆筒式匀浆器,聚四氟乙烯/玻璃匀浆器,同轴振荡器等广泛地运用成功。现在发现,在某种情况下,媒介液中添加某种惰性乳化剂,可以改进和简化混合程序。这种方法的特点是在常温和冰水中进行混合。当分散相降温时,媒介液形成固体,从而固定了液滴的位置。因此在低温贮藏肘,分散相不存在被破坏的机会。在实际运用中,过冷材料的贮藏温度常设置在-20°C。但在运输时常设置一个上限温度。不过,可以根据不同系统的要求通过选择不同的媒介物设置温度。现在,干冰包装的过冷样品已安全地运输到世界各地。然而,使用时,水相的恢复是极其简单的。一旦温度上升到足够使媒介物可移动时,分散相也就从媒介相中分离出来。但同时也可借助于一般离心机,这样就可以收集水相用于分析。
潜在的利用价值
过冷技术确实是一项使用广泛的技术。对于稳定酶和其它一定数量或者作为中间体的生物活性物质确是一项有效技术。过冷技术的一个实际应用的例子,便是为工厂保存相对的酶水平。
过冷技术也应用于细胞培养工作,特别是少量细胞系的中期贮存。同时,也成功地应用于乳酸菌和大肠杆菌的保存;而对于真菌原生质体保存也适宜。
过冷技术的优点
与目前其它不稳定生物样品保存技术相比,过冷技术具有多种不同的优点。首先是避免了结冰。冷冻贮藏和冷冻干燥贮藏都存在这样的问题。当温度下降时,冰晶析出,造成pH的剧烈变化,不可避免材料的活性和自然属性的丧失。过冷技术的另外一个优点是简单,低成本,贮存浓度低,便于分析等等。尽管冷冻贮藏和冷冻干燥贮藏对于一些运用更容易接受,例如,大体积的材料。不过,过冷技术贮存不稳定的生物材料一定将迅速推广。
[Trends in Biotechnology,1991年第9期]