重组毒素将细胞表面受体和肿瘤细胞上的抗原作为目标。它们通过与常规化学疗法不同的机理起杀伤作用，因此应该不会有对常规化疗剂的交叉抗性问题。而且，它们不是诱变剂，因此不会诱发次级恶性肿瘤或促进良性癌的恶化。在细菌中，它们可以以均一蛋白的形式廉价地大量生产。它们或者选择生长因子-毒素融合的方式，或者选择抗体-毒素融合的方式而起作用，这取决于它们在细胞上的靶。

重组毒素是利用重组DNA技术制造的，专为选择性杀死癌细胞而设计的杂种细胞毒素蛋白。它们在细胞上的靶可以是某种生长因子或某种单链抗原结合蛋白。有毒部分是某种细菌或植物毒素的一部分。免疫毒素虽然在概念上与之相似，但却是由与毒素利用化学键连接的抗体组成。

早在30多年以前，化疗药物就开始被用于治疗癌症，以作为外科及放射治疗的补充。几十年已经过去，现在已弄清楚，当代化疗药剂能治愈某些白血病和淋巴癌，并且作为辅助手段，能延长乳腺癌、卵巢癌及其他几种类型癌症患者的生命。但由于化学疗法不能治愈在成年人中常见类型的癌症，因此必须开发新的治疗手段。

一种方法是将某种细胞毒性剂的目标对准癌细胞，为了达到这一目的，可将该种细胞毒性剂与某种优先与癌细胞结合的抗体或生长因子连接。对这种治疗方法来说，靶位点可以是生长因子受体，分化抗原或其他性质尚不完全清楚的细胞表面抗原。现已证实，许多癌都产生过量的可以起致肿瘤基因作用并促进癌细胞生长的生长因子受体。例如，表皮生长因子受体在许多鳞状细胞癌及表皮样癌，成胶质细胞瘤和部分转移卵巢癌及膀胱癌中大量存在（多达每细胞中3×10⁶个受体），而正常细胞中每个只含3×10⁵个受体。白介素-2（IL-2）受体在成人T细胞白血病（ATL患者细胞中实际数目大约为每细胞3×10⁴个受体，而在许多其他淋巴样恶性肿瘤中数目较少。

在正常细胞如B淋巴细胞上出现的分化抗原通常也在肿瘤细胞如B细胞淋巴瘤上出现。因为这类抗原在产生B细胞的干细胞上不存在，任何被定靶治疗法杀死的成熟的B细胞将由来自干细胞群体的细胞取代，而癌细胞将不会被取代。最终，有些抗原在癌细胞上优先表达，其功能目前尚不清楚。这些抗原例如癌胚抗原中有一些是胎儿抗原，它们在正常成人组织中不是没有就是仅少量存在。这也包括一些来源不清楚的抗原，它们仅能通过利用其与单克隆抗体的反应活性才能得以确定。

为了成功地传送靶药剂，细胞毒性剂的效力必须非常高。细菌毒素和植物毒素是已知的细胞毒性最高的物质的一部分，在真核细胞中，它们通过不可逆地阻止蛋白质合成而起作用。假单孢菌外毒素（PE）及白喉毒素（DT）就是通过使伸长因子-2酶催失活而起作用的，伸长因子-2是蛋白质合成过程中的一个基本成分。蓖麻蛋白及其他植物毒素能切开28s核糖体RNA（rRNA）的一个糖苷键，于是破坏了核糖体合成蛋白质的能力。由于这些毒素是可多次重复使用的催化剂，因此只需很少毒素分子到达细胞质就能杀死靶细胞。这些类型的毒素通过细胞摄粒作用进入细胞并进一步变成活性片段穿过细胞膜移位进入胞液，这里分布有许多蛋白质合成的成分。如果绕过这一途径，直接将有活性的DT或PE注射进胞液，那么只需注射少数几个毒素分子就能杀死该细胞。

最初，将毒素传送到癌细胞的药剂是通过将抗体与毒素化学连接制造的。免疫毒素已通过将抗体连接到蓖麻蛋白A链或其他几种毒素以及经修改的DT和PE制得。最近，已利用遗传工程技术，通过将改造的毒素基因与编码生长因子的DNA成分或抗体的结合区融合制得重组毒素。

天然形式的毒素需要具有至少3种生化功能才能杀死细胞：细胞结合，细胞毒性及将毒素活性部分移进胞液的能力。在了解这些功能区的每一部分的结构基础方面，由于PE的结晶作用及其三维结构的阐明而取得一定进展。PE是一种分子量为66KD的单一多肽链，这条多肽链被安置成3个主要的结构区域。这种排列表明每一区域可能负责一种功能。为了验证这一假设，Hwang等人从绿脓杆菌中分离得到PE基因，并利用细菌表达体系生产出完整毒素或对应于每一结构区的毒素片段。结果表明，Ia区（氨基酸1-252）是细胞结合区，Ⅱ区（氨基酸253-364）是移位必需的，Ⅲ区（氨基酸400~613）为腺苷二磷酸（ADP）核糖基化及伸长因子-2的灭活所必需。称为Ib的亚区由氨基酸365~399组成，还没有已知的功能，其中大部分可缺失而不影响其活力。

在毒素结合后不久，毒素-受体复合物可通过受体介导的内吞作用途径进入细胞内部。该毒素经过纹孔进入内吞泡中，在这里通过蛋白水解步骤加上一个二硫键的还原而将毒素分子切成两个片段。来自羧基端的37KD片段包括部分Ⅱ区及全部的ⅡI区，它被移至胞液并在那里阻止蛋白质合成并导致细胞死亡。尽管移位作用由内吞泡引起，近期资料表明移位作用也可发生在内质网。

白喉毒素（DT）也是一种单链毒素，其中的功能区域是按与PE相反的顺序排列的，它的氨基端具有ADP核糖基化功能，羧基端为结合区。一般认为在大肠杆菌中生产的DT在与靶细胞结合以后被蛋白水解作用裂解。蓖麻蛋白由两个由一个二硫键连接起来的亚单位组成。A链含有梅催化活性；B链与许多不同细胞的表面糖蛋白及糖脂中出现的半乳糖残基连接。假单孢菌外毒素，白喉毒素及蓖麻蛋白各自都是以单一多肽链形式合成的。以后，这一条链被蛋白水解作用裂解成两个片段，其中含有毒性酶催活性的片段被移进胞液中。PE直到进入靶细胞，经过蛋白水解和二硫键还原才被裂解。相反，白喉毒素在分泌后不久就被修剪，蓖麻蛋白在合成它的种子内就被裂解。在这两种情形里，两个片段仍由一个二硫键连在一起，这一二硫键最终将在靶细胞内被破坏。

免疫毒素

为了构建有活性的免疫毒素，必须对毒素进行修饰以减少或完全排除它与细胞受体的相互作用。从而使毒素由抗体结合介导进入细胞。对蓖麻蛋白来说，这一过程是通过切除B链，阻断半乳糖结合位点或将富含半乳糖的糖类附着到B链完成的。对PE来说，这一修饰作用发生在将抗体连接到PE的I区的时候，它妨碍了I区与受体的结合，或发生在将I区（氨基酸1-252）遗传缺失并将抗体连接到Ⅱ区的时候。对DT来说，这一修饰作用通过在靠近羧基端的结合区中的一个关键性氨基酸的突变或通过移去负责与细胞结合的羧基端的一部分而发生。

蓖麻蛋白是从蓖麻籽中提纯的，并已用于免疫毒素生产多年。最近已在大肠杆菌中生产出重组型A链。PE已从绿脓杆菌的培养基中获得，但正如DT的突变型，完整的PE及其突变型都已在大肠杆菌中生产。某种免疫毒素的活性最初是通过测量它杀死表面带有靶抗原的细胞的能力来确定的。因为毒素在细胞内起作用，能通过细胞摄粒作用自然地进入细胞的受体及其他表面蛋白质通常成为免疫毒素很好的靶，而固定在细胞表面的表面蛋白就不合适。

在细胞培养中，许多免疫毒素能产生选择性毒杀力，但在动物中，只有少部分能引起实质性或完全的肿瘤退化。在小鼠中，连接到能识别B细胞特异性抗原的抗体的蓖麻蛋白A链已引起B细胞淋巴瘤的完全退化。而当利用对癌的抗体时，只能观察到部分反应。通过将单克隆抗体与同PE本身或PE40结合的卵巢癌、结肠癌及乳腺癌反应进行治疗，已获得在患免疫缺陷的小鼠中生长的人类癌的退化，PE40是PE的一种突变型，其中的细胞结合区已经缺失。在这些毒素中，B3-PE40能导致生长在小鼠中的人类肿痛的完全退化。

迄今已开发出几种免疫毒素并被批准用于人体试验。已进行了两种不同类型地试验。第一种试验包括正在接受自休骨髓移植的患者进行重注射之前，于活体外将免疫毒素加入采集的骨髓中以排除受污染的肿瘤细胞。在这项试验中已用到与蓖麻蛋白或蓖麻蛋白A链连接的各种抗体,包括抗-CD5和抗-CD7。第二种试验包括将免疫毒素局部地（例如腹膜腔）或系统地进行肠胃外的用药于癌症患者。这种治疗对淋巴瘤确实有效，因此将进一步扩展这些试验。迄今为止，已发现用来制备治疗癌或其他固状肿瘤的免疫毒素的抗体能与重要的正常人体组织（如神经组织和骨髓）反应并产生有限剂量的毒性而无明显的临床反应。

遗传工程重组毒素

利用化学连接法生产免疫毒素需要大量抗体及毒素，因而费用很大。此外，利用化学连接法生产异种基因产物以及抗原结合通常受到化学衍生作用的影响。利用遗传工程手段就有可能克服这些困难并生产出细胞毒性剂。在大肠杆菌中，已利用PE和DT生产出重组毒素。生产以蓖麻蛋白为基础的分子是很困难的，这可能是由于必须通过一个二硫键将植物毒素的A链附着到细胞识别区，而通过二硫键连接的亚单位很难在细菌中生产。加上一个蛋白水解的裂解顺序可能有助于克服这一困难。

PE的X光衍射晶体结构已被用于指导遗传工程重组毒素的合成。PE特异地结合到靶细胞通常通过它的工区与细胞的PE受体相互作用而发生。I区与Ⅱ区的连接发生在Glu²⁵²和Gly²⁵³之间。因此，在构建重组毒素时将I区缺失并将不同生长因子及其他靶性分子的羧基端氨基酸直接融合到PE的Gly²⁵³位点（偶而在生长因子的羧基端与PE的Gly²⁶³之间加上少数额外氨基酸作为接点以使其克隆更便利）。一个广泛研究的分子是TGF-α-PE40，它是通过用转化型生长因子α（TGF-α）取代PE的I区构建的。在这种嵌合毒素中，23-KD（千道尔顿）的I区被6-KD的生长因子取代，以生产出某种能选择性地结合并杀死带有表皮生长因子（EGF）受体的细胞的嵌合毒素。编码TGF-α-PE40的质粒结构中带有编码插入PE40基因附近的TGF-α的cDNA。用于生产TGF-α-PE40的表达载体及其他在大肠杆菌中以PE为基础的嵌合毒素含有噬菌体T7的启动子，一个有效的核糖体结合位点以及一个Nde I位点（CATATG），它编码一个甲硫氨酸起始密码，靶性配位体可在这里便利地插入。将编码噬菌体T7多聚酶的基因插入到邻近lac启动子的大肠杆菌染色体中，以便它能通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）而被诱导。

问题与展望

毒素属于外来蛋白质并具有高度致免疫的特性。因此，在没有免疫抑制的情况下，中和抗体将在与毒素接触大约10天后形成，而对DT的抗体在大多数接受了白喉、百日咳及破伤风（DPT）免疫接种的人体中就已经存在。动物研究已表明，免疫毒素和重组毒素能很快起作用，以致肿瘤在几天之后就能退化。类似的迅速反应应该也会在人体上出现。不过从长期治疗来看，为延长治疗期有必要同时施用免疫抑制剂，不然同一种抗体或配体能被用来靶击不同的毒素。在近期的临床试验中接受治疗的病人中，有许多接受了大面积化学治疗并被严重免疫抑制，因而能延长治疗期。在这篇评论中，我们已经讨论了正在临床开发的三种毒素的用途，但伴随着它们使用的同时仍有一些令人担心之处。许多生活在西方世界的人们由于孩提时代接受了免疫注射而带有对DT的中和抗体，这就导致了对含有DT的重组毒素的使用上的忧虑。蓖麻蛋白A链及块状蓖麻蛋白两者都能产生有活性的免疫毒素，但迄今所生产的重组分子只有很低的细胞毒活性。PE的长处是它的结构已经弄清楚。并且，以其结构为指导，已利用一打以上的不同配体包括几种不同的单链抗体成功地取代了它上面的细胞结合区。此外，在人群中只有少于3%的人预先就有对PE的抗体。我们期望，在未来的几年里，在经外科手术或放射治疗以后仍不能治愈的转移性疾病的治疗中，作为辅佐药物，免疫毒素和重组毒素将扮演重要角色。

［Science，1991年11月22日]