缺乏维生素B₁₂可导致恶性贫血。人们不能合成维生素B₁₂，但可从生物体中提取。了解微生物如何合成很重要。研究表明，需要间接攻克，并结合遗传学、分子生物学、酶学、化学和光谱学。本文逐步阐明了维生素的合成途径。为探索活生物体内物质的合成提供模式，此研究对动物饲料和人类健康具有深远意义。

生命色素

活生物体内的鲜艳颜色和有机金属系统起源于一种母体分子一一尿卟啉原Ⅱ的广延变体。因这些变体分子可爱的色彩和在生物体内维持生命的功用而被喻为生命色素。如，血液中血红素运输氧；植物应用叶绿素a，镁复合物完成光合使用；其它类似的复合物能传递电子；辅助因子能还原亚硝酸盐和亚硫酸盐，而镍复合物能调节甲烷产生，还有维生素B₁₂。

维生素B₁₂生物合成的初始阶段

以上所有的生命色素，包括维生素B₁₂，可由尿卟啉原Ⅱ生物合成，后者由8个5-氨基乙酰丙酸（ALA）分子2×2配对产生4分子卟吩胆色素原（PBG），在酶调控下PBG聚合而构成。血红素与维生素B₁₂结构比较，主要有两个方面不同于B₁₂。第一，B₁₂大环因A环与D环直接相接而较小。第二，分子外部环绕重甲基化碳，组成许多手征性中心。在庞大的结构顺序中进行着甲基化作用、环收缩、钴嵌入及其它步骤。摆在生物合成面前的世界难题是如何破译天然合成的步骤和全部中间物的结构。

在放射性同位素¹⁴C³和H应用之前，化学家们仅了解类固醇、生物碱和卟啉的天然合成途径。本世纪50到60年代用¹⁴C和³H作标记物质。用¹⁴C做标记，把酶结合到假定的先质中解决了不少生物合成问题。接着设计了放射性分析。

核磁共振光谱计观察-3核的应用，在60年代末得以认识B₁₂生物合成的主要过程。并可研究复合分子的标记部位。¹⁴C和³H标记也有重要作用，但-3才真正是此研究的开端。

直到80年代中期，用丙酸杆菌属研究B₁₂。这种杆菌能在钴培养基中生长，菌细胞破坏后释放细胞游离剂，加上适当的辅助因子可由初级前体合成钴啉酸。菌细胞生长随着钴的消耗，不再合成钴啉酸，但产生三种新色素。重新合成脱氢中间物，即前咕啉-1、前咕啉-2和前咕啉-3，标记证实经生物合成转化过程能合成钴啉酸。

靠¹⁴C标记和³H、-3核磁共振光谱研究三种新色素和前咕啉-7、8、9和的结构。表明要经过三步C甲基化作用，依次为C-2、C-7和C-20。这种甲基化作用在B₁₂、血红素和叶绿素a途径中不同。通过甲基化因子S-腺苷甲硫氨酸传递甲基。

1903年以前，用此研究法继前咕啉-3后未再分离出新的前咕啉，而用其它方法却获得成功。

一种方法重在研究C-20甲基化合成前咕啉-3。复合标记试验显示A环和D环连接形成钴啉酸之前，两个碳原子随乙酸排出。用放射标记发现了约9 μg的乙酸。

第二种研究方法用脉冲标记来揭示合成的顺序规律。-3标记甲基显示，C-17是第四个甲基化点，然后依次是C-12a、C-l、C-5和C-15。钴啉酸的12β-甲基不是衍生SAM，它是12-乙酸盐脱羧作用的残基，仍可合成前咕啉-3。

B₁₂生物合成的初始阶段已解决以下关键问题：（1）维生素B₁₂、叶绿素a和血红素都由ALA合成尿卟啉原Ⅱ。（2）之后B₁₂途径发生分支，转折点始于尿卟啉原ⅡC-1甲基化。（³）形成前咕啉-2，接着是前咕啉-2、前咕啉-3，最后按顺序增加了5个甲基-C-17、C-12a、C-1、C-5和C-15。（4）A-D环直接连接，大环因而缩小，C-20结合的甲基随乙酸排出。

研究B₁₂生物合成的最新进展

依靠-3 NMR识别B₁₂生物合成途径是早期研究的重大进展。但研究者未掌握前咕啉-3以后的中间物。随后在遗传学和分子生物学基础上研究B₁₂。化学家用特异酶催化中间物之间的转化。基因的充分表达能产生大量的酶。同位素标记和-3 NMR及现代NMR技术的拓展能更好地研究中间物的结构。开始认为约有20个基因参与B₁₂生物合成，经证实仅少数基因与酶的作用相符。

惊人的发现

法国研究组对P. denitrificans（—种细菌）株的遗传研究发现，需要8个基因的充分表达，可使前咕啉-2合成B₁₂后期的先质氢化钴啉酸。这种先质是钴啉酸的游离钴态，P. shermanii（另一种细菌）的产物。钴啉酸和氢化钴啉酸的复合有机环相同，仅钴嵌入位点不同。

由这种菌株获得的可溶性蛋白含8个基因编码的酶。能提供使前咕啉-3转化为氢化钴啉酸所必需的辅助因子，包括SAM和还原型NADPH。如没有NADPH增加，虽产生一种黄色色素，但不形成氢化钴啉酸。复合酶系包括NADPH，可使这种黄色色素在转化为氢化钴啉酸过程中得到一种新中间物。双标记显示新中间物是在前咕啉-3中增加了3个衍化SAM甲基，因而叫前咕啉-6A，而后在酶转化下形成氢化钴啉酸。NMR研究发现氢化钴啉酸的3个新甲基和前咕啉-6A—样都位于C-17、C-12a和C-1。

标记和质谱研究前咕啉-6A的结构完全出乎意料。第一，大环已收缩，C-20甲基被挤出。第二，C-12保留乙酸盐残基并含7个双键，因而有6个咕啉大环。显然合成维生素B₁₂需要还原。

巴黎-剑桥研究组阐明了前咕啉-6A的结构和重要性。计划用复合酶由简单引物ALA合成前咕啉-6A。核磁共振光谱更加深了对其结构的认识。

为什么前咕啉-6A的结构会发生这样的变化？主要揭示出B₁₂有意外的合成途径。最突出的是前咕啉-6A甲基化在C-11（不在C-12）和上述情况。这种甲基转移发生在前咕啉-6A转化为氢化钴啉酸的后期。

多酶合成法

相应基因的充分表达产生九种酶，利用这些酶的联合作用，可由LAL合成前咕啉-6A这种复合分子的7个手征性中心。现已能通过酶（6种或更多）的混合作用进行多酶合成法。酶合成法有巨大潜力，并能进一步通过无酶法控制产物。要利用酶的作用，实际上需要几小时也许是几天时间。许多研究组多年的研究已能通过无酶法合成前咕啉-6A。

还原步骤

CObK基因编码酶和还原型NADPH能还原前咕啉-6A，可分离出还原产物前咕啉-6B。在复合酶系和辅助因子参与下前咕啉-6B可转化为氢化钴啉酸。

C标记发现前咕啉-6A的C-18和C-19之间双键被还原。等价氘化物[4—²H₂]NADPH（14a）转移到前咕啉-6A的C-19；增加于前咕啉-6A的质子被还原，重点研究辅助因子[4R—²H]NADPH（14_b）和[4S-²H]NADPH（14_c）的制备，研究者能揭示立体特异还原酶传递辅助因子14的H_R。调查了在还原过程中三种成分（底物、辅助因子和产物）不能离开双键，表明这种还原步骤是需氧菌P. denitrficns合成B₁₂的必经过程。

前咕啉-3与氧化钴啉酸的氧化程度相比较，无全面的氧化还原变化，有乙酸排除。因前咕啉-6A需还原，说明前咕啉-3和前咕啉-6A之间某阶段有氧化过程，表明厌氧菌p. shermanii合成B₁₂需要相同的还原步骤。

前咕啉-6B之后的合成途径

认为前咕啉-6B大概要经过以下步骤：（1）12-乙酸基脱羧；（2）11-甲基转移到C-12；（3）C-5和C-15甲基化作用。试验了前咕啉-6B作为生物合成中多种酶的底物。成功鉴定了甲基转移酶的活性，从而证实了C-5和C-15甲基化，提纯了CobL基因编码的酶，催化12-乙酸基脱羧。分离出转移酶的产物前咕啉-8X。³H和¹⁴C同位素标记证明它是B₁₂合成途径中的一个中间物。

巴黎和剑桥研究组一直致力于B₁₂中间物结构的研究。在[2. 3-¹³C₂]ALA作引物基础上，用¹²C标记发现C-12增加了一个甲基，C-12是SP²中心，前咕啉-8X结构虽缺乏立体化学详情，但已掌握了主要特征。

前咕啉-8XC-11甲基转移到氢化钴啉酸的C-12，是由于亲1，5-6的重新排列，并受CobH基因编码的分子量相对小的酶（22，000）催化。酶催化甲基转移在将来是一个有趣的问题。这种转移允许双键变为轭合，确立了氢化钴啉酸特有的咕啉色基。

遗留问题的最终解决

在这个时期，掌握了从ALA到前咕啉-3和氢化钴啉酸合成途径中全部中间结构。但到前咕啉-6A还有空白。需要深入了解基因、酶如何转化氢化钴啉酸；如何添加腺苷残基和核苷酸环，以及维生素B₁₂辅助的结构。

P. denitrificans中由尿叶琳原Ⅱ到氢化钴琳酸途径需9个基因（CobA、F、G、H、I、J、K、L、M）编码酶。肯定了CobK、CobL、CobH编码的三种酶的功能。CobA和CobI编码的酶在6到9途径起作用。CobA编码甲基转移酶，催化前咕啉-2和C-2和C-7甲基化；CobI编码酶催化C-20甲基化，产生前咕啉-3。前咕啉-3转为前咕啉-6A需要CobG、CobF、CobJ和CobM编码酶。CobFs CobJ和CobM编码酶与CobA、CobI编码的甲基转移酶有同源性。3个C甲基化与3个甲基转移酶相吻合。现不清楚，CobG在何处及如何编码蛋白？CobF、CobJ和CobM按什么顺序发挥甲基化作用？

用基因缺失和基因完全表达的方法来研究这4种基因。首先在P. denitrificans株缺失CobM基因。这个菌株所含蛋白提取物可使前咕啉-3转为前咕啉-4。分离出的纯净物称因子IV。当P. denitrificans与含NADPH的复合酶一起培养时，因子IV还原前咕啉-4，可转化为前咕啉-6X。¹³C标记和NMR揭示因子IV的结构似16a，二者可能是互变异构体。

前咕啉-4结构也出乎意料，环收缩表明伴发乙酸排出。以前推测乙酰基位于C-19，C-1和C-20的¹³C标记合成前咕啉-3证明在C-1，接着由酶转化为前咕啉-4。衍化因子IVl6a的NMR分析表明两个碳¹³C标记直接结合。要合成前咕啉-4，发生了C-17甲基化和氧化（总的增加了一个氧原子）。

脉冲标记研究也证明加入大环的甲基在C-17。氢化钴啉酸和钴啉酸的12a-甲基是第五个增加的甲基，最初主要在C-11。当CobM缺失，就不发生此甲基化，CobM编码P. denitrificans的11-甲基转移酶。

CobG编码的酶只进行氧化而无甲基化就能转化前咕啉-3。新的中间物含同量甲基，以前称前轱啉-3，应改为前咕啉-3A。氧化产物为前咕啉-3B。前咕啉-3B、在生物体内转化为前咕啉-4，确为B₁₂生物合成的中间物。氧化不引起环收缩，相反，下一步CobJ编码C-17甲基转移酶催化环收缩。纯化的氧化酶不用血红素作辅助因子，但铁-硫簇能维持其特性。所有的证据表明，CobG酶是最初的氧化酶，CobJ编码甲基转移酶保证C-1甲基化。

从复合酶系中除去CobF基因编码的蛋白，C-1甲基化受阻，产生前咕啉-5，它可由CobG、CobJ和CobM酶催化前咕啉-3A或CobM酶催化前咕啉-3A或CobM酶催化前咕啉-4生物般合成。

基因、酶和钴嵌入

CobB编码酶使氢化钴啉酸转为它的a、c-二酰胺，通过CobN、CobS和CobT编码的复合酶催化，为钴嵌入作准备，后产生咕啉酸a，c-二酰胺。B₁₂生物合成的早期研究应用了钴啉酸。P. denitrifican和P. shermanii的合成途径到此合拢，钴嵌入的时间在两种途径的较早期至少不同。P. shermanii含钴大环发生变形。

结束语

维生素B₁₂的生物合成是复杂的，现在所有的合成步骤已经清楚。首次解决了B₁₂的结构，并且化学家们逐次掌握了活生物体怎样生产这种维生素，终于为这项始于39年前的研究画上了圆满的句号。

[Science，1994年6月10日]