（中国科学院上海生物化学研究所）

蛋白质可逆磷酸化几乎调节着生命活动的，每一过程。细胞的生长和分化，具体到基因复制转录调控、蛋白质合成调控和代谢调控，分子识别和信号传递，肌肉收缩，肿瘤发生以及包括学习记忆在内的神经活动等都与蛋白质磷酸化密切相关。蛋白质的磷酸化调节方式最早是在50年代由Krebs和Fisher在研究糖原磷酸化酶时发现，他们因此获得了92年的诺贝尔奖。正是由于蛋白质磷酸化作用所具有的显著而又广泛的生物学意义，围绕着磷酸化的研究已成为当今生命学科中的一个最活跃的研究领域。

蛋白质的磷酸化是由蛋白激酶催化产生的。到目前为止，发现的蛋白激酶有200多种。蛋白激酶催化的反应看上去是比较简单的，它以ATP和蛋白为底物，将ATP的末端（γ-）磷酰基转移到蛋白的某一残基的侧链上。根据催化的磷酸化位点的氨基酸残基的性质，通常将蛋白激酶分为五类：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、组氨酸（精氨酸/赖氨酸）蛋白激酶、半胱氨酸蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶。其中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶是最主要也是最大的蛋白激酶家庭。近几年，发现了一些双专一性蛋白激酶，它们既催化丝氨酸/苏氨酸的磷酸化，又催化酪氨酸残基的磷酸化。尽管蛋白激酶的种类繁多，然而它们都是由一个共同的祖先进化而来。也就是由同源进化而来。目前已知的蛋白激酶基本都存在一个比较保守的由约270个氨基酸残基构成的核心催化结构域。在这些众多的蛋白激酶中，许多激酶本身也受磷酸化的调节，换句话说，它们是其它蛋白激酶的底物。在诸如细胞信号传导、细胞周期调控等系统中，蛋白激酶形成了纵横交错的网络，通过一系列的蛋白（包括蛋白激酶本身在内）的磷酸化形成了严密的调控网。随着对这些调节网络的揭示和对磷酸化调节意义认识的不断加深，有两个问题始终是研究者所关注的，也是希望得以阐明的。一个问题是什么决定了蛋白激酶作用的专一性，另一个问题是磷酸化如何影响了蛋白的功能，也就是磷酸化作用的结构基础问题。

关于蛋白激酶作用的专一性问题，这些年主要的研究思路可以说集中在对蛋白底物磷酸化部位区域的肽段序列特征的了解上。发现了一些规律性的特征。比如，PKA催化的磷酸化位点的序列特征为：R-R-X—S（T）—Y，X-般是比较小的残基，Y一般是比较大的疏水残基；酪蛋白激酶2（CK2）的识别序列为：X-2-X-1-S（T）-X+1-X+2-E（D），等等。然而，序列特征显然还不能完全解释蛋白激酶的底物专一性。底物的三维结构也在很大程度上影响了蛋白激酶的专一性。根据已报道的一些研究工作，有的蛋白不能被某个蛋白激酶作用，但却有被其识别的肽段序列；有的蛋白可以被某个蛋白激酶作用，但它的磷酸化区域的肽段却不能被蛋白激酶识别。前面一种情况是蛋白底物的三维结构影响了蛋白激酶对其原本存在的特征序列肽段的识别与磷酸化作用，而后一种情况显然说明蛋白激酶识别的是三维结构而不是一级结构（序列特征）。此外，还有一些别构酶的磷酸化位点往往在某些别构剂对酶的作用下才充分暴露出来；有些蛋白受某个蛋白激酶作用的位点只有在其它的位点被另外的蛋白激酶磷酸化后才暴露出来，等等。这些都反映了蛋白激酶作用专一性的复杂性。到目前为止，可以说对于这一方面的认识还是十分浅显的。对蛋白激酶作用专一性的深入研究、揭示与阐明不仅有助于人类对于涉及到蛋白质磷酸化的细胞活动的深刻认识，而且在此基础上，将产生一系列预防和治疗人类疾病的有效药物。所以说，这方面的研究不仅有重要的理论意义，也有十分广阔的应用价值。

众多的蛋白质被蛋白激酶磷酸化后，功能上受到了影响，一般来说，或者是受到了激活，即从无活性到有活性或从低活性到高活性，或者是受到抑制，即从高活性到低活性甚至完全失活。形象地说，蛋白质的磷酸化对于其功能就好比是个开关。蛋白质磷酸化与功能调节的关系是丰富多彩的，归纳起来大致有以下几种：（1）单一部位的磷酸化导致单一的功能变化。这种情况比较多见，一个蛋白存在一个磷酸化位点，例如糖原磷酸化酶、异拧檬酸脱氢酶和HPr蛋白等。磷酸化或是导致了激活（糖原磷酸化酶），或是导致了抑制或失活（HPr和异拧檬酸脱氢酶多个部位的磷酸化导致单一的功能变化。许多受体受调节的磷酸化位点往往是多个的。G蛋白偶联受体的C末端存在多个被G蛋白偶联受体激酶（GRKs）作用的磷酸化位点，胞内第三loop区还存在PKA或PKC的磷酸化位点，这些位点的磷酸化都导致受体与G蛋白解偶联从而产生所谓的脱敏现象；（3）多个部位的磷酸化分别导致不同的功能变化。举两个具体的例子；胆汁酸运输/ATP酶蛋白有两个磷酸化位点，Ser-503被PKC磷酸化是该酶功能必需的，而Tyr-488被酪氨酸激酶磷酸化不是必需的，但是有显著的激活调节效应。P34cdc2是细胞周期调控中的一个重要的蛋白激酶，它本身也受多个位点的磷酸化的调节。Thr-161位点的磷酸化是其功能必需的。然而，Thr-14和Tyr-15的去磷酸化则是必需的，换句话说，Thr-14和Tyr-15的磷酸化导致P34cdc2的失活；（4）单一部位的磷酸化导致多个功能的不同变化。这种情况是针对多功能蛋白的。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酯酶是一个集两个酶（即：6-磷酸果糖-2-激酶和果糖-2，6-二磷酸酯酶）的活性于一身的双功能酶，受PKA催化的磷酸化调节，Ser-32残基磷酸化的结果是不仅抑制了位于该酶的N-端（1-250）的激酶的活力，同时也激活了位于C-端（250-470）的酯酶的活力，从而形成了对该双功能酶的双向调节。除T以上几种情况外，还发现了一些蛋白被磷酸化但其功能不受影响的情况。

到目前为止，对磷酸化作用的认识主要还是它产生的效应或结果，而对于磷酸化导致功能变化的结构基础了解还很少。简言之，磷酸化究竟对蛋白做了什么以至于影响了其功能，对这一点我们了解的还不多。根据为数不多的研究实例，磷酸化的调节机制主要可归纳为几种模式：（1）磷酸化部位远离功能部位，磷酸化产生的结构信息经过了一个远距离的构象传导而影响到活性部位。可以说，磷酸化的结果导致了蛋白构象的巨大变化。对于许多别构酶，通常它们的磷酸化位点靠近蛋白的N-或C-末端，可能多属于这类模式。到目前为止，对这一模式研究得比较清楚的例子是糖原磷酸化酶的磷酸化。通过对磷酸化和去磷酸化两种形式的糖原磷酸化酶的晶体结构的解析，清楚揭示了磷酸化导致的结构变化。（2）磷酸化部位靠近功能部位，磷酸化直接导致了功能部位区域的构象变化。例如，依赖c AMP蛋白激酶（PKA）的197位Thr残基是该酶的一个自身磷酸化位点，这个位点十分靠近催化部位，磷酰基与催化残基（Asp-166）相邻的一个残基（Arg-165）有直接的相互作用。同时，磷酰基与催化亚基的上下两个结构域都有相互作用，从而使得催化部位呈现较紧密的结构7这个位点的磷酸化对PKA的催化功能是十分重要的。比较另外两个蛋白激酶P3f2和MAPK的结构，可以看出相应于PKA的Thr-197的位点（Wf2的Thr-161，MAPK的Thr-183和Tyr-185）的去磷酸化形式酶的活性部位表现一种开放的构象，与催化或底物结合有关的一些残基的位置不合适等。由此可以看出该位点的磷酸化对维持局部构象的重要性。另外一个例子是，Hpr蛋白的Ser-46的磷酸化直接导致了其功能部位His-15附近区域也是该蛋白的一个表面的结构的变化，从而影响了其功能。（3）磷酸基团的空间位阻效应和电荷效应导致蛋白结合功能的丧失。如异拧檬酸脱氢酶，Ser-113磷酸化后，该酶失去了结合底物异拧檬酸的能力，原因是磷酸基团占据了底物异拧檬酸的一个羰基的位置。（4）此外，还有一种模式是磷酸化本身提供了一种被其它蛋白识别的标志。与酪氨酸蛋白激酶相关的受体所介导的信号传导的过程，首先是活化的受体或自身磷酸化，或被游离的酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的Tyr残基则被下一步的信号蛋白上的SH2结构域所识别和结合，使信号进一步传递下去。在这里，受体上的Tyr残基的磷酸化起着一种标志的作用。

综上所述，尽管到目前为止，被了解的磷酸化调节机制的例子并不多，但已反映出模式的多样性。总的来看，磷酸化的作用也可以分为两类，一类是相对静态的影响，比中磷酸基团本身的空间位置和标记作用；另一类则是磷酸化引入了一个负电性基团，与蛋白分子上其它基因——主要是带正电荷的碱性残基的相互作用，改变或调整了蛋白的空间构象，使其在活性或高活性和非活性或低活性两种'状态中变化。蛋白质，特别是酶的活性调节方式非常多，许多调节方式不外乎以上两类。那么磷酸化的作用与其它调节方式之间是否会有什么联系。现在已有不少研究工作表明，磷酸化对某些蛋白结构和功能的影响确实与其它一些调节方式，如别构调节、糖基化等相似或相同。这表明磷酸化的调节性寓于蛋白质本身的结构与功能的特定关系中。揭示磷酸化作用的结构基础也就是从一个方面揭示蛋白质的结构功能关系，这正是当前结构生物学研究领域的一个十分重要的部分。只有揭示和阐明磷酸化作用的结构基础，才可能从本质上深刻认识磷酸化作用于生命活动的重要意义。

蛋白质磷酸化涉及到生命活动的各个方面，贯穿于生命科学研究的各个领域。围绕着磷酸化的研究势必对揭示生命现象的本质，对预防和治疗人类疾病有效药物的开发应用具有十分重要的理论和应用价值。