自80年代初，诺贝尔奖得主K · 穆利斯（Kary Mullis）首次采用聚合酶链式反应技术（PCR）以来，PCR技术作为一种快速检测微量特殊DNA序列的方法，在DNA分析的研究中，得到了广泛重视。在过去5年中，PCR技术令人信服地渗透到美国刑事司法体系的棘手领域如法医巾的人的鉴定，血缘关系测试等。

DNA分型方法首次为法庭是供证据是在1988年。从那以后，该技术在150多次法庭审判中起了重要作用。目前，至少有13个签约实验室为美国刑事案件进行DMA实验。

PCR方法用于法医鉴定，是为了最大限度地简化商品化检测，又是对普遍使用的限制性长度多态性方法（RFLP）的补充。然而PCR方法在诸如O. J. 辛普森（O. J. Simpson）案件的法庭审判中一直具有明显的优势，以至于美国国家司法研究院最近授权国家标准技术研究所为成熟的法医PCR方法制定一套标准的参照样品（SRM）。

PCR引物

PCR技术中所使用的序列特异的寡核苷酸探针，被称之为引物。它被用来特异性地连接到一个靶基因或一个短的DNA片段上，在酶的作用下启动片段的复制（这被称为放大）。在同一样品试管中，进行几轮循环，使得所需DNA片段有足够的拷贝数用于分析。该过程分为以下几个步骤：首先，试管中的模板DNA被加热至90℃左右，使DNA双链解链，然后，当试管内温度降至约70℃时，加人引物、游离的核苷酸，以及具有热稳定性的DNA聚合酶。在该温度下，引物与样板DNA配对连接，该引物含有一个片段，它能指示聚合酶在其所在位置开始复制DNA。

如果引物不与模板上的任何DNA序列配对，上述过程就不会发生。倘若它们一旦配对，那么聚合酶就开始复制模板DNA链上相配对的片段。每当下一温度循环开始时，DNA又被重新加热，而新合成的链又从模板上分离下来。这样，聚合酶进行着一遍又一遍的拷贝过程，每一过程，都复制着加倍的DNA。大约30个循环过程后，所需的DNA片断可以倍增至100万。

在PCR技术应用的最初几年里，人们对其高灵敏性的推崇实际上存有疑态。该方法确实非常灵敏，以至从其它样品或从操作者手上所感染上的极低DNA量也会被扩增，以至带来错误的检测信息。那时，进行DNA工作的正规实验室规程还不足以控制感染，因此一些研究者建议施行全隔离措施，包括使用超净工作间和分离的通风槽，以避免感染。然而直至80年代后期，有效的商用热循环装置采用及常规PCR试剂规程的改进，才解除了这些难题，使得PCR成为DNA分析的一种常规方法。

人群差异性

致力于DNA技术研究的D · 里德（Dennis Reeder），作为NIST小组的负责人与其组员一道，于1992年制成了一套用于RELP技术方法的SRM试剂盒。今年夏天，他们又制成了一套用于PCR方法的新SRM试剂盒。

里德称，当PCR技术最初用于人的鉴定时，由于许多法医实验室使用许多各种不同的DNA位点，这使得作为方法有效性和可解释性的两个因素——个体概率的研究和实验室间的可比性几乎不可能，从那时起，TWG-DAM，NRC和其它持上述观点的小组确定了几种在人群中具有高变异性的DNA位点，并为进行人鉴定的PCR方法提出了指导原则。这些小组为新发现的DNA位点继续制定法医PCR方法规程。

事实表明，商品化标准业已简化，较查（Roche）分子实验室拥有PCR技术的专利，并许诺该项技术可准予其它公司用作有限的临床、法医和研究产品开发之用。在三个最常见的商品化规程中，一个用作DIS80位点，另一个用于人类M核抗原（HLA）DQα位点的扩增和鉴定探针组。位于华盛顿特区的FBIDNA中心实验室的部门主任J · 林赛（Jenifer Lindsey）表示FBI及大多数与司法相关的实验室将这些规程作为其标准方法。

反义斑点印迹法是在法医PCR方法应用中最为常见的鉴定方法。例如，人的鉴定和父本鉴定，其原因在于该方法的顺序只需几小时。林赛进一步解释说，作为对照，RFLP分析是通过凝脉电泳片段定位（测距），来测定较长可变区域的特征长度，若使用放射自显影标记来观察分离的DNA则需要几星期。

RFLP分析需要大量完整的DNA片段，然而PCR是在较短DNA片段上鉴定序列长度变化的，故能在已降解的DNA样品上完成鉴定工作。里德说，PCR方法所需的鉴定样品量更少或许仅1~ 2 ng的DNA，而RFLP分析需要从样品中提取总计20~50 ng的DNA。

然而，与PCR测序相比，RFLP分析鉴定个样使用DNA位点的量最终要少得多，“因为PCR方法是一个离散的体系”，里德说，“其数量并非完全有效”。法医科学家开始尝试从与犯罪现场证据可能相吻合的范围内排除怀疑对象。大多数法庭要求有一个4或5探针的匹配作为RFLP分析，证实有涉及案件的证据（即，一个怀疑对象就是一个可能的匹配）。对于PCR方法的碱基体系，则需要有9或10个探针的匹配才能获得这种特征，面对于RFLP仅需要一个5探针的匹配即可。“虽然在每个样品的分析上，这听起来是一个惊人的数字”，林赛解释说“用PCR方法，对结果你所需要做的一个不同之处就是去排除怀疑对象”。“从另一方面来说，目前还没有一种测试用作完全的鉴定，至于正确鉴定某人所必须的DNA位点的匹配数是多少，目前仍有争议”。

林赛还表示，方法的选择，并不是用PCR替代RELP这样简单。“我将两者均视为检测手段。因为，在我们实验室中，两种方法均采用，我可以由法医样品来决定所需使用的方法”。“在较好情况下，对于含有DNA的大量血液或精液污物，可优先考虑RELP方法。面对于残留在香烟嘴上和邮票上的唾液细胞，PCR方法则是一种可供选择的方法，用来扩增来自于唾液细胞中的微量DNA。林赛还说，一些实验室全部采用PCR方法，这是因为大多数标准RFLP方法使用P作为放射自显影的标记探针，然而并非所有的实验室都被许可使用放射性物质。而且，非放射性标记物正在商品化。“我们希望在今年年底将化学发光检测用于现场检测。”

研制标准试剂盒

用于法医PCR的NIST SRM试剂盒将很有可能被用来确定某个实验室是否有能力达到成熟检测水平的行列，而这对于从FBI获得联邦基金来说则是必须的。这种试剂盒被设计成对人的鉴定和父本测试PCR方法的检查除错。当然该试剂盒相当复杂，据里德说它含有足够多的不同的材料来确定实验室PCR规程是否存在问题，若有，可进一步鉴定错误出在哪一步。该试剂盒被证实可用于DIS80DNA的分型，而且该试剂盒还包括有从白细胞中抽提的基因组DNA，再者该白细胞样品分别来自8个人。对所测基因位点而言，被选来这8人为个体间基因变异的最高数字。

DIS80多态性因片段长度而各异（与RFLP，相似，但要短许多），并且通过凝胶电泳而不是反义斑点印迹来确定，标准化的等位梯段会有14~37个重复单元长度的混合片段。该试剂盒中8个人的参照样品含有等位基因（可遗传的变异）的长度范围为17~37重复单位，在8种基因型中，有些为同源性的（即来自父母双方的等位基因具有同样长度），能给出诸如“18，18”这样的结果，且在胶上产生一条单带，其它异源基因，产生一个双带（例如“18，24”）。其中，有的常见，有的并不多见。该试剂含有人类性别发生的基因组DNA原坯。

未来的方法

里德说，8个基因组DNA标准已有足够的变异来容纳其它DNA分型方法，例如像HLADQα分型及多点标记分型。里德进一步说，应该使该试剂盒适于新的PCR方法，倘若这些新方法确实可行且不必从人群中寻找并加入新的DNA基因组。

里德还表示，目前正在考虑的用于法医鉴定的新方法包括有短序列重复PCR，该方法鉴定变异碱基长度可短至2~4个重复片段。并可能有助于分析高降解的DNA。另外，该方法还使鉴定人的残留物成为可能，它通过线粒体DNA的PCR扩增和测序来实现。而线粒体DNA仅从母本一方获得遗传，在有些事故中，残留物并非很容易鉴定。那么就要通过将当事人的线粒体DNA与其兄弟姐妹或其母系亲戚的DNA相比较来进行确认。NIST实验室的其他计划还包括“疑难”DNA的检测，这类DNA含有线状、环状和其它结构或序列特点，而这些特点会增加进行PCR及DNA测序的难度、

林赛称FBI计划建立一个联合DNA索引系统（CODIS），即一种基于RELP位点的国家DNA分型数据库，今年秋天将完成美国全国范围的联网。该系统还允许对PCR分型的结果加以保留，它由尚未侦破案件当事人以及被指控犯有抢劫或杀人罪行的罪犯的分型DNA所组成，此两类犯罪案件通常须要求通过DNA分型进行鉴定，最近，授权成立的DNA指导委员会将为FBI制定成熟的实验标准，而CODIS将与该委员会在一起，在美国司法界，对扩展DNA分型标准和增加侦破案件的能力应有所作为。

[Analytical Chemistry，1995年10月]