哺乳动物卵母细胞受精后随之开始连续的分裂和分化，先是形成早期胚胎，然后形成构成成年动物的各种类型的细胞。将处于发育到某一特定阶段的单个细胞的核转入已去核的来受精的卵母细胞，这为观察细胞分化至该阶段是否涉及不可逆的遗传修饰提供了一个机会，首例由诱导进入静止期的已分化的胚胎细胞核移植发育而成的后代已经诞生。用同样的方法。我们在此报道来源于成体乳腺、胎羔和胚胎建立的三种新细胞群的成活羔羊的诞生。羔羊来源于成体细胞这一事实证实了，这种细胞的分化并未涉及发育所需的遗传物质的不可逆修饰。来源于已分化的胎羔细胞和成体细胞的羔羊的诞生还加强了以前的推测，即通过诱导供体细胞进入静止期，将有可能使各种已分化细胞得到正常的发育。
人们早就知道，取自两栖类动物体外培养的角质化细胞的核，移植后可支持发育至幼年的蝌蚪阶段，尽管这已涉及复杂的组织和器官的分化，但还没有报道可发育至成年期。从而留给人们一个疑问，即已分化的成体细胞核能否再重新开始分化。先前我们报道了诱导进入静止期的体外培养的胚胎细胞核移植产下了成活的羔羊。我们提出诱导供体细胞退出生长期可引起染色质结构的变化，从而促使基因表达重新编程，而且如果用的是处于相同情况下的各种已分化的供体细胞核，其发育也将是正常的。我们现在研究胎羔或成体组织来源的供体细胞在核移植前被诱导退出生长周期而进入G0期时，能否完成正常发育。
三类新细胞分别取自（1）9天的胚胎 :（2）26天的胎羔 :（3）怀孕最后3个月的6岁母羊的乳腺。胚细胞的形态（图1）与我们以前研究用的小鼠胚胎干细胞和胚胎细胞都不相同。核移植按我们建立的方法之一进行，重建的胚胎被植入受体母羊。在动情期50~60天后。超声扫描检测到21个单胎（表1）。其后每14天扫描一次，观察到的胎羔减少了， 这可能是由于误诊或流产。总计有62%的胎羔丢失，明显高于自然交配后大约6%的丢失率。已有报道胚胎操作或未重建胚胎的培养均增加出生前胎儿丢失，怀孕110天左右，四个胎羔死亡，它们都来自胚胎细胞，杀死母羊后进行尸检。发现两个胎羔肝脏发育不正常，但未检测到其他异常，也未发现受到感染。
图1供体细胞群的相差显微摄影
a.胚胎细胞（SEC1； b.胎羔成纤维细胞（BLWF1； c.乳腺细胞（OME；d.用四种多态性绵羊标记对受体母羊、核供体细胞和羔羊进行的微卫星DNA分析。从上至下，母羊与羔羊的排列次序一致，细胞类型分别是胚胎细胞（SEC1）,胎羔细胞（BLWF1），乳腺细胞（OME），羔羊与供体细胞有相同的基因型，而与受体母羊则不同。
表1三种不同细胞重建的胚胎的发育
* 融合后一小时在解剖镜下检测。同一列中的上标a或b指受体细胞在融合效率上的显著差异（P<0.001）或胚胎发育至桑椹胚或胚泡的比例（P<0.001）。
' 不能做到移植所有的桑椹胚/胚泡。
" 相对于移植的桑椹胚或胚泡的比例，并非所有受体是完全同步化的。
$ 该羔羊在出生几分钟后死亡。
8头母羊生下活的羔羊（表1、图2）。代表了所有三种细胞类型，一头来源于胎羔成纤维细胞的羸弱羔羊，全重3.1公斤，出生几分钟即死亡。尸检未发现任何异常或感染。12.5%围产期的死亡率，与对商品羊大规模研究发现8%的羊羔在出生后24小时内死亡并无多大差异。所有羔羊均表现核供体品种的而不是卵母细胞供体的形态特征（表2）。单是这个事实就表明羔羊既不是卵母细胞供体，也不是受体母羊未被注意到的交配而生下的。而且细胞群的和羔羊的4个多态性位点的DNA微卫星分析证实，每只羔羊是来源于用作核供体的细胞群（图1）。妊娠期由胎羔基因型决定，所有羔羊的妊娠期均长千妊娠母羊品种的平均天数（表2）。相比之下，体重受到代孕母体和胎羔基因型的共同影响。所有羔羊出生时的体重都在本农场黑面母羊产下的单胎羊羔的出生体重范围之内（最大6.6公斤），大多数羊羔的体重在核供体品种的范围之内。品种间胚胎移植后的出生体重未作严格的对照观察，但本农场中芬兰多赛特（Finn Dorset），威尔士山（Welsh Mountain）、无角多赛特（Poll Dorset）品种各自产下羔羊的出生的体重的范围分别是1.2~5.0公斤、2~4.9公斤和3~9公斤。羔羊到达性成熟的时期正在监测之中。
图2来源于芬兰多赛特（Finn Dorset）母羊乳腺细胞的羔羊6LL3和受体母羊——苏格兰黑面母羊
表2来源于三种不同供体细胞核移植的胚胎发育至娩出羔羊的妊娠期和出生体重
* 芬兰多赛特羊（Finn Dorset）,黑威尔士山羊（Black Welsh Mountain）和无角多赛特羊（Poll Dorset）这3种基因型的平均妊娠期分别为143、147和145天，
+这只羔羊在出生几分钟后死亡。
" 这些羔羊经剖腹产出，兽医外科大夫提供的帮助与商品羊的剖腹手术完全一样。
核移植形成的胚胎的发育依赖于染色体正常倍性的维持和创造出适于基因表达的发育调控的条件。这些反应都受供体细胞和受体细胞所处细胞周期的阶段以及它们之间相互作用的影响。将细胞核移植到卵母细胞或去核的合子（受精卵）后产生小鼠和牛的胚胎。比较它们的发育后指出，受体若是卵母细胞，发育成功率大。这可能是因为在移植核内引起基因表达重新编程的因子是早期发育所需，并被原核合子的发育期间所摄入。
如果受体细胞质是由处于分裂中期Ⅱ的卵母细胞去核制备的，这是唯一可能在转入二倍体核之后避免染色体损伤和保持正常染色体倍性的途径。但仍需进一步实验以确定最适的细胞周期阶段。我们以培养细胞研究的结果表明，处于静止期的细胞有优势。早期研究用的供体细胞是未被诱导进入静止期的胚胎卵裂球细胞。比较生长周期的各时相，发现各供体细胞处于有丝分裂或G1期比处于S期或G2期的发育更好些，用处于G0、G1或有丝分裂期的供体细胞发育较好，可能反映了更多地接触到存在于卵母细胞质中的重新编程因子，但要更清楚地认识其机制，需在同一细胞群中直接比较这些时相。
汇总上述结果表明，通过利用细胞周期各阶段的适当组合以增加重新编程的机会后，许多种类型细胞的细胞核应证明是全能的。由此，在精选的优良畜群中得到的遗传改良的推广将通过动物的有限复制而得到加强，那就是从成年动物身上取得细胞进行核移植，此外，家畜的基因打靶（gene targeting）现通过移植已修饰的细胞核在而成为可能，并为生物技术提供新的机遇。这些技术也为研究后天变化的可持久性和影响提供一个机会。所谓的后天变化如已知分别在发育和衰老期间发生在体细胞中的印记（imprinting）和端粒短缩（telomere shortening）。
就我们所知，乳腺细胞核移植后生下的羔羊，是来源于成体组织细胞的第一只哺乳动物。尚不清楚供体细胞的表型。原代培养物主要是乳腺上皮细胞（超过90%）和其他已分化细胞，包括肌上皮细胞和成纤维细胞。我们不能排除这种可能性，即有一小部分相对未分化的干细胞能在妊娠期内支持乳腺的再生。羔羊的出生表明在乳腺细胞的发育期间，没有发育所需的遗传信息的不可逆修饰。这同公认的观点相一致，即哺乳动物的分化几乎全由核与变化的细胞质环境相互作用引起的基因表达的系统而有序的变化所决定。
方 法
胚胎细胞取自一只无角多赛特母羊的9日龄胚胎的胎盘，培养方法略作以下修改，干细胞培养基加牛DIA/LIF。8天后，分离的胎盘经酶解后，细胞重新接种在新鲜滋养细胞上。7天后，分离出一个大而平展的细胞克隆，继续在无滋养细胞的培养液中生长。在第8代，模式染色体数为54。取7~9代的细胞作核供体。胎羔细胞取自一只内脏切除的黑威尔士山羊怀孕26日龄活检的胎羔。在将组织切成碎片之前先去头，细胞经胰蛋白酶解离。培养液是BHK加L-谷氨酸（2 mM），丙酮酸钠（1 mM）和10%的胎牛血清。培养细胞90%汇合时，以1 :2比例传代。第4代时，这些纤维细胞样的细胞（图1）的模式染色体数是54。第4~6代的胎羔细胞被用作核供体。乳腺细胞取自妊娠期最后三个月的6岁芬兰多赛特（Finn Dorset）母羊。第3代和第6代培养细胞的模式染色体数是54，第3~6代的细胞用作核供体。
核移植按照以前的方法。卵母细胞取自注射了促性腺激素释放激素（GnRH）后28~33小时的苏格兰黑面母羊，卵取出后立即去核。去核的卵母细胞被置于含1%胎牛血清（FCS）的无钙离子、镁离子的PBS中，再移至含10% FCS的无钙M2培养液，37℃培养。降低血清浓度（从10%降至0.5%）5天，使细胞退出生长周期并滞留于G0期，以产生静止的二倍体供体细胞。以anti PCNA/生长周期蛋白（cyclin）抗体（Immuno Concepts）染色，用与玫瑰红素（rhodamine）结合的二抗（Dakopatts）显示，确证细胞已离开原来的细胞周期。
核供体细胞与去核卵母细胞的融合及卵母细胞的激活均在供体母羊注射了GnRH34至36小时之内用相同的电脉冲诱导。大部分重建的胚胎培养在连接的输卵管，但有些胚胎细胞或胎羔成纤维细胞核移植产生的胚胎在一种化学成分确定的培养基中培养。培养6天后，大部分胚胎发育至桑椹期或胚泡，像以前做的那样被移植入受体母羊而发育至出生（表1）。每只母羊移植一个、两个或三个胚胎取决于可供实验用的胚胎数。细胞类型对融合和发育至桑椹期或胚泡的影响用Breslow和Clayton的边界模型（marginal model）分析。还不能做到移植所有发育到适合移植阶段的胚胎，因此不可能比较整个发育过程。有很多胚胎可用时，则选择那些形态较好的胚胎。
在动情期60天后，用超声扫描作妊娠诊断，然后每2周监测胚胎发育。怀孕的受体母羊的营养状态、身体条件和EAE体征（signs of EAE）、Q热（Q fever）、border disease、慵懒病（loiping ill）和弓浆虫病（toxo-plasmosis）受到监测。临产前，母羊一直处于观察之下，分娩时召来兽医外科大夫。用4种多态绵羊标记对羔羊和受体母羊作了微卫星DNA分析。
致谢，感谢A. Colman在本实验进行之间和对本文的指导；感谢C. Wilde惠赠乳腺细胞；感谢M. Ritchie，J. Bracken，M. Malcolm-Smith，W. A. Ritchie，P. Ferrier和K. Mycock的技术指导；感谢D. Waddington所作的统计学分析，感谢H. Bowran及其同事对动物的照料。本研究由农业、渔业和食品部（Ministry of Agriculture，Fisheries and Food）提供部分资助。实验按1986年动物法条例，经罗斯林研究所动物保护和实验管理委员会同意实施。
[Nature，Vol. 385，1997年2月27日］