（上海瑞金医院神经科）

帕金森病（PD）是中老年人中一种常见的神经变性疾病，目前的药物及手术治疗只是对症性的，并不能阻止病情的发展，几乎所有病人在疾病后期会出现严重的症状恶化而无法控制。尽管胎脑细胞移植已在实验动物和少数病人被证明可产生一定疗效，但这一治疗方法面临着伦理道德上的争议和供体细胞来源的限制，因而不大可能被广泛采用。利用基因治疗手段将外源基因导入病变部以纠正PD的病理和生化异常可能是一种更实用、更具潜力的治疗手段。PD的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元变性，导致信状体多巴胺含量严重不足。这一较为局限的病理改变和明确的生化异常非常有利于PD基因治疗靶区的确定和目的基因的选择，因而PD较其它神经变性疾病更合适于基因治疗。实际上，目前世界上大多数中枢神经系统疾病基因治疗研究都把PD作为研究对象，我国也把PD基因治疗实验研究列入了国家863计划。经过多年努力，PD基因治疗取得不少进展，显示了诱人的发展前景。但也毋庸讳言，目前的PD基因治疗仍局限于动物实验，要想在临床实际应用，仍有不少技术问题有待克服。

一、PD的基因治疗技术

与其他疾病的基因治疗一样，目前PD基因治疗也是针对细胞的，其技术路线大致有两条：体外途径（ex vivo）和体内途径（in vivo）。体外途径又称间接基因转移，它是指在体外先将目的基因导入供体细胞对其进行遗传修饰，然后将经过遗传修饰的供体细胞移植到脑内。移植到脑内的基因修饰细胞起着生物微原的作用，它可持续地向局部输送神经递质、神经营养因子等生物活性物质。体内途径又称直接基因转移，它是指将目的基因直接导人脑细胞。这一方法无需供体细胞的介导即可向脑细胞提供所需要的神经活性物质。

（一）间接基因转移与供体细胞选择

间接基因转移的优点是可预先明确转移基因能否表述所需要的产物，还可对其致癌性及细胞毒性作出估计，主要的缺点是操作复杂。供体细胞的选择对体外途径的基因治疗效果影响很大，理想的供体细胞标准是：①易获得，易培养，易筛选；②可使目的基因稳定表达；③与宿主有较好的免疫相容性，植人脑内可长期存活；④无癌变倾向。目前，PD基因治疗所采用的供体主要有：①成纤维细胞；②肌细胞；③内分泌细胞；④星形胶质细胞。从研究结果看，这些细胞离上述标准均有一段距离，相对而言，原代成纤维细胞、肌细胞及成肌细胞基因修饰移植效果极好，它们的酪®酸羟化酶（TH）基因表达及对大鼠PD模型的行为改善时间可维持数月至1年。

从理论上面言，脑内移植最佳供体细胞当属神经细胞，但一般神经细胞培养困难，移植后也不易存活。最近发展的两类具有神经起源性质的细胞可能具有较好的应用前景。一种为来源于胚胎或成年脑内的神经组细胞（progenitor cells），这类细胞具有分化成神经元或神经胶质细胞的潜力；第二类如用非转化原癌基因（nontransforming oncogenes）处理神经细胞获得的条件永生化细胞，这类细胞在一定的条件下可像肿瘤细胞一样增殖但又可保持神经元的特征。目前对这两类细胞的研究应用尚处于起步阶段。

（二｝直接基因转移与载体选择

直接基因转移更有利于目的基因的表达及其生物学效应的发挥，因为神经细胞有更合适的表达环境及相关的修饰、分泌机制。比如，直接基因转移除可提供神经递质、神经营养因子等分泌性产物外，还可用于提某些细胞内蛋白如蛋白激酶、受体、转运体等。直接基因转移的不足之处是不能预先对转移基因的安全性进行估计。尽管裸DNA直接注射也可在脑内得到表达，但其转移效率极低，因此直接基因转移需要选择合适的载体系统。目前体内直接基因转移应用的载体系统有脂质体和病毒两大类。脂质体作为基因运载工具有简单、安全的优点，但转移效率仍不够理想，进入细胞的基因易乱失，不能稳定表达。研究发现脂质体介导的TH基因转移在脑内的表达时间仅2周左右，这一表达时间对PD这样一种慢性变性疾病来说显然是不太合适的。PD基因治疗中应用较多的载体是利用基因重组技术制备的复制缺陷病毒，适合PD直接基因转移的病毒载体主要有单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒，这些病毒载体各有长短，总的来说，它们介导的直接基因转移表达时间及治疗效果优于脂质体，一般可达数月至1年以上。但病毒载体仍未达到理想的程度，其安全性及转染效率，转移基因长期表达仍有待提高。利用人类免疫缺陷病毒（HIV）改造获得的轮状病毒可能有较好的发展前景，有研究发现它可使外源基因在神经细胞得到长期表达，且无明显的毒性作用及免疫反应。

二、PD基因治疗的目的基因选择

PD的致病基因分离尚未获得成功，目前的基因治疗主要是针对其发病机制的外围因素。与这些外围因素相关的目的基因大致可分为两大类，一类与多巴胺替代治疗有关，如酪氨酸羟化酶（TH）、GTP环水解酶I（GTP cyclohydrolase I）、芳香氨基酸脱羟酶（AADC）基因；另一类与多巴胺能神经元神经保护有关，如神经营养因子、超氧化物岐化酶（SOD）基因。

多巴胺合成不足是PD最主要的生化改变，通过基因转移提供多巴胺合成过程中，所需的酶促进多巴胺的合成是PD基因治疗首先采用的治疗战略。TH是多巴胺合成的限速酶，研究发现PD病人脑内TH活性显著降低，很多PD基因治疗研究均将TH作为目的基因，这一基因转移的疗效已在PD动物模型上得到证实。四氢叶酸（BH₄）是TH的重要辅助因子，体内和体外研究均表明BH₄对TH基因转移后的生物效应的发挥有很大影响。由于GTP环水解酶I是BH₄，合成的限速酶，在TH基因转移时同时转移GTP环水解酶I可增加左旋多巴及多巴胺的生成量，因此CTP环水解酶也可作为PD基因治疗的目的基因。多巴胺合成的第二步需AADC催化，体外研究表明AADC对于多巴胺的合成是必需的，但PD患者脑内似乎并不缺乏AADC，在TH基因转移时同时补充AADC反而会产生有害的效果，研究发现TH基因和AADC基因一同转移时左旋多巴和多巴胺的生成量明显低于单纯TH基因转移，产生这一现象的原因可能是多巴胺合成的终产物对TH的负反馈调节。因此，AADC基因转移对PD治疗并无益处，甚至有害。

—些神经营养因子如脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）被认为是极具潜力的PD治疗药物，它们对多巴胺能神经元的营养保护作用有望阻止PD的神经变性，促进损伤细胞修复。但这些神经营养因子难以透过血脑屏障，因而很难直接应用于临床。基因治疗有望较好地解决这一问题。移植BDNF基因修饰的成纤维细胞已被证明可有效避免外源性神经毒对多巴胺能神经元的损伤作用。最近，腺病毒及腺相关病毒载体介导的GDNF直接基因转移也取得了类似的结果。除了神经营养因子以外，清除自由基的酶如超氧化物岐化酶（SOD）对多巴胺能神经元也有保护作用，SOD直接基因转移可用来减轻PD的病理损害。

PD基因治疗未来发展的关键是对基因转移载体进行改造以使其在安全性、长期表达及可调控表达方面达到较为理想的水平。此外，间接基因转移时供体细胞也需进一步完善。对PD致病基因的分离有望提供新的治疗基因。