线粒体DNA出现突变比预期快的结论，推动了新的法医学程序，却增加了有关进化事件断代的困难。
1991年俄罗斯人挖掘出并检验了西伯利亚一座葬有9具骨殖的坟墓。有人认为那是俄罗斯末代沙皇尼古拉二世和家人及侍从的遗骸，他们是1918年被行刑队枪杀的。但是有两人失踪，所以没有人能完全确认遗骸身份。1992年做了DNA试验——期望能够较快地得到结论——使之不再增加新的难解之秘。
沙皇线粒体的一些DNA-细胞内的细胞器都有自己的DNA——与他还活着的亲属们的DNA并不十分相符。法医学专家们认为大多数人只有一种线粒体DNA（mtDNA），但是沙皇却有两种：在相同的位点上时而含有一个胞嘧啶，时而含有一个胸腺嘧啶。他的亲属只有一个胸腺嘧啶，错误配段给骨殖真实性的争论増添了难度。
沙皇骨殖的疑问，在挖掘和检验了他的兄弟俄罗斯罗曼诺夫大公的遗骸之后，才事告平息。1996年的《自然遗传学》上公布了这次DNA的分析结果，和沙皇一样，公爵也从他们的母亲那里继承了两个不同的mtDNA顺序，即通称的异种原生质现象（heteroplasmy）。然而，解决了罗曼诺夫遗骸的奥秘，却又增加了其它方面的难题。开始时使法医学专家们苦恼，现在又转而苦恼看进化论学者们。曾经协助鉴定过沙皇骨殖的马里兰洛兹维尔武装力量DNA鉴定实验室的分子遗传学家，托马斯 · 帕森斯（Thomas J. Parsons）惊叹道：“究竟要多长时间才会意外地出现一次异种原生质现象呢？”
新近的一些研究认为，事实上异种原生质现象是经常发生的事情。武装力量实验室主任、分子生物学家米切尔 · 霍兰（Mitchell Holland）说，他们发现，人类中的突变率至少为10%，很有可能达到20%。由于异种原生质现象是因突变产生的，因此这种出乎意料高的突变率，证明了mtDNA突变比原先估计的要多得多——估计要快20倍以上。这些研究结果，引起了一场震动。但是，其它的研究结果表明，并未发现这么高的突变率。
正确地解答这个问题很重要，像帕森斯等人，要用mtDNA鉴定士兵的遗骸，证实有罪或者是免除犯罪嫌疑的时候，过高的突变率可能使其样品中丢失一个对应的材料。而对于那些使用mtDNA突变率作为时钟，断定人类祖先分布于全球关键期的进化论者们，就会卷入麻烦之中。
进化论者们曾经假设这个时钟是恒速的，大约每6,000~12,000年记下一次突变。但是，如果该时钟计时太快，或者是在不同的时段中具有不同的速率。那么，有些轰动一时的研究成果，如我们祖先大约在40,000年前才首次进入欧洲的记录，就成了问题。得克萨斯大学医学分部的遗传学家尼尔 · 豪厄尔（Neil Howell）说：“我们曾经探讨过，它像一只秒表，而现在我却担心它只是一个日晷仪，担心我们在推动这个系统的时候，超过了我们所应该做的。”
计算突变
自从1981年解决了线粒体DNA中小环的顺序之后，它们就成为进化论和法医学研究的有力工具。细胞核中的DNA来自精子和卵子，与之不同的是mtDNA只来自母体的卵子，因此可以用这些mtDNA追踪母体的祖先，而不用来自双亲两者经过复杂作用后的混合基因。生物体内每个细胞都有数百个产生能量的线粒体，所以寻找mtDNA就比寻找核DNA更加容易。
看来它很像一种比较直接的遗传系统。研究者们能够计算出不同种群人中mtDNA相同顺序中的区别，并且假设出一个恒定的突变率，用以计算出群体的分歧需要多长时间。但是，沙皇案例突出地表明了人们对mtDNA遗传途径知之甚少。他的母亲必须具有或者是需要有一次突变，她的卵细胞中才会有数百个各自含有两类mtDNA的拷贝。然后，她才能把一些含有两类mtDNA传递给她的儿子们。但是，究竟要多长时间才会发生一次这样的突变呢？
人类和黑猩猩共同拥有一个祖先时期，作为人类非编码的mtDNA使用最高的突变率，其可信的时段估计为500万年。该时段是根据所有大型猿类之间的mtDNA和蛋白质区别来计算的，它们的分歧则是用一种大型猿类祖先的化石估算的。大学公园宾夕法尼亚州立大学的分子人类学家马克 · 斯通金（Mark Stoneking）说，人类大约每300~600个世代或者是6，000~12，000年（假设一代为20年）产生一次突变。这些估算可以用其它的考古学时段加以校正。然而，所公布的时段仍然会产生大额的误差。有些研究已开始提出真实的突变率会更快。这就促使研究者们考虑他们所依据mtDNA时钟的时段可能加倍。
例如，对沙皇DNA研究之后，帕森斯惊奇地发现，失踪士兵家属中突然出现的异种原生质现象，比所期望地更为经常。他和在美国和英国的同事们开始对士兵的家属，阿门教派和英国家族的mtDNA进行系统的研究。
研究者们从134个不同家族的357个人中，顺序了mtDNA对照区的610个碱基对，描述了327次生存事件或者是327次母亲把mtDNA传给后代的事件。进化论的研究结论使他们本来预期大约每600个世代（即12，000年）发生一次突变。所以，当他们发现10个碱基对改变，就有一次突变的时候，即每40个世代或者是每800年就有一次突变，使得他们“大吃一惊，不知所措”。
豪厄尔研究组独立地作出了相同的结论，他们深入地调查了一个罹患利伯遗传性视神经病（即利伯氏病或球后视神经炎）的家族，这是一种由mtDNA基因突变引起的疾病，研究者们分析这个家族中的40名成员的mtDNA时，发现有一名成员在其对照区（可能和疾病无关，因为它不是编码的mtDNA）带有两次突变。这种情况叫做三联原生质现象（triplasmy），因为包含了非突变顺序，所以细胞中具有三种不同的mtDNA顺序。
通过追溯家族谱系，豪厄尔就能判断一位出生于1861年的妇女，可能出现两次突变，产生每25-40个世代一次突变的分歧率。豪厄尔说：“我们双方的研究具有惊人相似的结论这项研究结果刊载于《美国人类遗传学月刊》1996年的末期上。他们还告诫说，系统发育研究明显地低估了mtDNA分歧率。
一些进化论者的研究组，很快地返回各自的实验室，计算他们已知家族谱系中的mtDNA突变。目前，斯通金研究组已经有了特里斯坦达坎哈的大西洋岛上密切相关家族对照区中经过顺序的部分。他们追溯到19世纪早期该谱系中的5位女性奠基人。但是，这项研究并没有发现较高的突变率、在瑞典的33个家族研究中，也没有发现较高的突变率，瑞典厄普萨拉大学的遗传学家乌尔夫 · 盖伦斯狂（Ulf Gyllensten）说：“我们拜读过豪厄尔的研究报告，但要在我们研究的家族中寻找突变却是徒劳的。”他的这份报告发表在《自然遗传学》杂志上，另外还有许多研究工作，正在波利尼西亚、以色列和欧洲开展着。
由于以上研究结果产生了麻烦。科学家们便把自己的数据和其他人提出的异种原生质研究结果汇合到一起，希望找出一个较为准确的全而的突变率数值。根据帕森斯、斯通金和盖伦斯登的论文，这种兼容的突变率大致为每1,200年一次突变，尽管帕森斯和豪厄尔并没有观察到如此快的突变率，这个突变率也比进化论者们提出的每6,000-12,000年一次突变的估计高出得太多。盖伦斯登说：“各自研究的突变率相差如此之大，表明我们还未掌握一些未知的变量。”
蒙特利尔神经病学研究所的分子遗传学家埃里克 · 肖布里奇（Eric Shoubridge）提醒说，根据已做过的少数研究，突变率的差异可能是统计学上的误差。因此，就应该当作增长过大的样本而舍弃。至于其它的可能性则是：DNA上某些位点的突变率比其它的位点高——即所谓的“热点”（突变）。慕尼黑大学的分子遗传学家斯范特 · 帕博（Svante Páábo）说，实际上，帕森斯和豪厄尔的研究中，几乎所有的突变，都发生在热点上。
但是，帕森斯怀疑用热点说明他观察到的所有突变。他说，如果对照区中非编码DNA不完全免除选择压力的话，就能够解释长期和短期突变率之问的某些区别。例如，对照区促进mtDNA的复制和转录。所以，任何干涉这些过程效率的突变，就可能是有害的，并因此而选择了抵制、降低表面上的突变率。
不管起因如何，进化论者们最关心的是快速突变率的作用。例如，研究者们计算出“线粒体的夏娃"，这位具有祖传mtDNA的妇女，生活在100,000~200,000年前的非洲。而用新的时钟计算，她才只有6,000岁。
但是，并不是人人都准备以活人中的几个突变率，作为根据去重新断定进化的历史、牛津大学的遗传学家马丁 · 理查德（Martin Richards）说：“完全是在无事找事。”他认为快的突变率至多返回数百年。
然而，这正好处于法医学案例的时间框架之内。对于这些分析，异种原生质并不始终是一个复杂的因素。当一个家族中具有1个以上的成员时，就会加强对鉴定的信任度，例如，沙皇的案例。但是，另一方而，如果1个罪犯的mtDNA与犯罪现场的核糖体样本不同的话，就会使他摆脱嫌疑，因此，帕森斯和霍兰对二次大战到目前的220具士兵遗骸的鉴定中，运用了新的准则——FBI也同样使用这个准则——来计算快速的突变率，凡来自有关案件或者犯罪现场中的失踪士兵或者犯罪嫌疑人的mtDNA。只要提出了一点差别，科学家们就不再称之为“错误配对”，而代之以经过思考的“证据不充分”作为结论。而且，直到目前有些进化的结论还是用mtDNA时钟取得的。
[ Science. 1998年1月］