微生物学正在经历一个转变：对微生物群落的新的认识可能引发一场革命；如果我们成功地控制住细菌的感染，将会给医药、工业、生态学和农业带来新的发展契机——
图1.黄石国家公园充满了很多不同寻常的只有用显微镜才能看到的生命，如嗜热藻类和丝状细菌(右下图)。这些生物往往会形成生物膜，这对大自然摄影师的眼睛来说或许是显而易见的，但我们还不能很好地了解它们。尽管早在17世纪微生物的生物膜就被发现，但科学家们将大部分精力集中在微生物的单生或浮游生物的形式上。不过，实际上大多数微生物都是以较大的群落生活在一起，连在一个表面上的。这种生活方式深深影响了它们与其他生物的相互作用，以及它们作为病原体的“弹力”。对生物膜的新的研究可能会改变微生物学研究的方向——有希望控制住由细菌和其他微生物引起的传染。
当我们思考细菌时，大多数人会想象出一个有水的环境——单细胞生物在其中游来游去。我们还可能想象出这些孤独的生灵会不时地和它们的一些同伴聚集起来引起某种疾病，或是使一些食物变质；但是一旦完成这项工作，它们又回到彼此分离的状态。现在证明：对细菌的这种印象不仅过于简单化，而且也可能是个误解。事实上，大多数微生物都是以较大的数量生活在一起的(并非彼此分离，也不“孤独”)，它们连在一个表面上。大部分细菌并不是以所谓的浮游生物的形式像孤独的隐士那样生活，而是在一个门控群落——生物膜中度过一生中的多数时光。
一个成熟的生物膜有着令人着迷的组成：它可以形成层、团、脊，或甚至以更复杂的排列成茎杆状或像蘑菇一样的小菌落。组成膜的“居民”可能是一个单一的物种，也可能是分布在附近多个区域的不同的微生物群。它们共同的联结物就是一种由多糖、DNA和蛋白质组成的细胞间质，这些物质在一起形成了一种胞外聚合物——许多微生物学家称之为“粘质”。
越来越多的证据表明，这种群居生活给微生物提供了相当多的好处。与其他细胞的接触促进了协作相互作用，这甚至发生在不同物种的成员之间。这些协作相互作用包括：微生物之间遗传物质的横向转移，分享代谢副产物，对抗菌剂的耐受性增大，避开环境中的变化和不受被感染宿主的免疫系统的攻击，或免遭捕食者的蚕食。生物膜的这种形成甚至被比作多细胞生物中细胞分化的程序。
相对而言，对生物膜的重要性的了解是近来出现的现象。仅仅在过去的15～20年，生物学家才开始研究这些微生物群落的生理学。我们知道在17世纪后期荷兰人列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek，1632-1723，微生物学的开拓者，他是第一个用放大透镜看到细菌和原生动物的人——译者注)第一次描述了生物膜。他用醋酸试图杀死一种生物膜——他假牙上的牙垢，但他注意到只有能自由浮游的细菌才能被杀死。尽管有微生物群落的这项早期发现，微生物学还是离开了这些观察结果，把主要精力集中在浮游细菌上。
自然，并非每个人都赞同生物膜实际上是细菌的占优势的形式。现在仍采用传统的实验室方法研究以浮游生物模式培养的微生物。但是我们相信，微生物学正在经历一个转变，即该如何给细菌下定义。我们预测，对微生物如何生存的新的展望将会给医药、工业、生态学和农业带来重要结果。
图2.生物膜的形成与多细胞生物体的发生类似，后者用细胞间的信号调控生长和分化。当自由浮游细菌被吸附到一个有生命的或无生命的表面时，一个典型的生物膜就形成了(从左上开始沿着箭头所示)。这种细菌和表面的吸附最初是可逆的，其后就不可逆了。吸附引发了生物膜生活方式上最初的一些生理学变化。随着细菌的生长和分化，在细胞间传递的分子信号不断提供关于细胞密度的信息——这个过程被称为“群体感应”(群体感应是指细菌通过产生可扩散的小分子量自体诱导物信号分子感知细胞群体密度变化，进行基因表达调控的生理行为——译者注)。在一个成熟的菌落中，微生物会产生一种胞外聚合物，即由多糖、DNA和蛋白质组成的将微生物菌落结构包被的细胞间质。浮游细胞可以离开所在的生物膜去建立新的生物膜结构，而菌落发出的信号也可以招纳新的微生物物种加入到这个同生群中。
图3.牛的瘤胃里有一个多物种生物膜，它为了解微生物群落中细胞间错综复杂的关系提供了一个很好的例子，图中没有提到生物膜在反刍动物和其他动物的营养中所起的作用。这个菌落始于降解纤维素的细菌，该类细菌可消化反刍动物吃的草(反刍的食物能在牛的口和瘤胃之间往返几次，然后这些反刍的残余产物才被送到它的胃和肠道)。这些细菌分解纤维素产生的简单的单糖和二糖会吸引发酵微生物，后者能把这些糖转变成有机酸。反之，有机酸又吸引产甲烷细菌加入到生物膜中。未被牛的唾液中和的有机酸，正常情况下将抑制生物膜的进一步生长，但是产甲烷菌类会把有机酸转变成甲烷。这整个过程产生了能被牛消化的富含蛋白质的微生物群，为动物提供了大量的营养物质。
生物膜无处不在
大多数人对覆盖在河流、小溪中岩石上的滑溜溜的物质很熟悉。这种特殊的粘质是一种由细菌、真菌和藻类组成的水生生物膜。细菌在岩石的表面“安营扎寨”后，这种粘质就开始形成并产生胞外聚合物(聚合物之间靠静电作用维持)，这样聚合物就能捕获食物颗粒、粘土和其他矿物质。被捕获的这些物质形成了微小的生境，每个小生境都有一个独特的微环境，这样就允许有不同需求的微生物集合到一起构成形形色色的微生物同生群。
生物膜的细胞间质被认为是一种水凝胶，即一种复杂的水合多聚物(其重量是其干重的许多倍)。粘质的水凝胶特性使其具有流动性和弹性，这就使生物膜能抵挡住环境中产生的剪切力的变化。因此生物膜常常形成带状，这实际上是被束缚在一个表面上的微生物的胶粘的“集合”体。当水流过生物膜时，一些膜片段或许会脱落，从而把微生物群落传播到下游(现在认为，在通风设备上的细菌能够以这种方式“植入”病人的肺部，对病情严重的病人来说这往往可导致致命性的肺炎)。
微生物这种传播扩散的惊人能力可以解释生物膜如何会出现在最不太可能出现的地方。轮船浸没在海水中的钢铁船体可能被微生物膜覆盖，这增加了航行阻力并因而降低了船速。还有一些生物膜对金属造成细微的腐蚀，使金属管道的使用寿命缩短，给工业带来很大破坏。由原核生物(即无细胞核的生物)的远古世系(被称为“古细菌”)组成的一些生物膜，甚至能够经受住温泉和深海热水出口处的不友好的湿热环境。被恰当地命名为“热网菌属”(Pyrodictium)的古细菌在海底呈现出一派繁荣景象，它们像一层松软的土壤，生长在海底热水出口处的黑暗、厌氧环境中的硫晶体上，这里的温度可能超过110℃。
也许人们发现生物膜的最特别的环境之一就是奶牛的腹部。在许多健康的动物中，生物膜是正常微生物补体的一部分，不过反刍动物中这些微生物群落的存在，也提供了生物膜内部多种相互作用的丰富例证。
我们从瘤胃开始。瘤胃是牛胃中最大的一个隔室，它能够容纳的液体超过150升。瘤胃中充满了如此多的微生物，以致微生物学家把牛称作“移动的发酵罐”。小牛出生仅2天后，细菌就出现在其消化道中；3个星期内，微生物就改变了瘤胃内部的化学环境，不久瘤胃就成了微生物的家园——有30种细菌、40种原生动物和5种酵母菌(生物膜中的这些细胞在胃的粘膜层里茁壮成长，以动物摄取的食物为生)。当然，牛吃的草主要由纤维素组成，纤维素是一种复杂的多糖，且不能被哺乳动物的消化酶分解。但是纤维素是生物膜中细菌的理想“燃料”，细菌将其转变为微生物量，微生物量反过来又提供了牛所需的蛋白质、脂类和糖类。
上述过程的核心是一个显微生态系统。当瘤胃中最初的浮游细菌，例如瘤胃球菌属的一个物种Ruminococcus flavefaciens进入了一片叶子的内部，有可能这片叶子已经被牛咀嚼烂了，这个过程就开始了。这些细菌附着在叶子内层的纤维素上，进行分裂繁殖而形成了基本的生物膜。这些微生物释放出降解纤维素的酶，后者分解纤维素可产生简单的糖类和代谢副产物，糖类和代谢副产物又可吸引其他的细菌——例如像螺旋状的Treponema byrantii之类的厌氧菌，它们摄取糖类而产生有机酸，包括醋酸和乳酸。
这些酸性的代谢物正常情况下将通过反馈抑制过程使一些细菌生长变慢，不过其他的微生物会加入到生物膜群落中来吃掉有机酸。例如产甲烷菌和古细菌，它们的行为会加速细菌群落的生长和阻止反馈抑制。顾名思义，产甲烷菌会产生甲烷——而且是大量的甲烷。每年全球释放的甲烷中大约15～25%(总计75亿千克)可归于反刍动物的肠胃气胀！因为甲烷可以捕获大气中的热，所以隐藏在牛胃中的生物膜或许在全球气候变化中起到了非凡的作用。
图4.植物和生物膜之间的关系：从健康状态(左上)到发病的状态(右上)的全过程。许多生物膜是无害的：腐物寄生菌仅消化枯萎的叶片，而真菌常常只是用附生植物作为机械支撑。有些相互作用甚至可能是颇有价值的：位于地下的布满了细菌的小瘤能使植物固氮；某些真菌的生物膜增大了植物根部的表面积，以利于吸收水分和营养物质；一些共生的细菌释放出可杀死潜在病原菌的物质。不过令人遗憾的是，生物膜也可能压制了植物的防御机制，从而导致从地下、甚至从导管系统攻击的疾病过程发生。苛养木杆菌(Xylella fastidiosa，右，一个25微米宽的环节)对葡萄和柑桔等生长物来说就是一个大问题。
图5.许多生物膜能导致人类的疾病和不适。如烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus，左上，一种真菌)导致潜在致命性的肺部感染；病原菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，左下)对囊肿性纤维化(cystic fibrosis)病人可能是致命的；生长在隐形眼镜上的细菌生物膜(右上)或导尿管上的生物膜(右下)能导致严重的感染。
动物并不是给生物膜提供“家园”的唯一生物。20世纪60年代以来，在热带植物和杂货店的水果、蔬菜等产品上也发现了微生物菌落，但是直到过去的10年里，“生物膜”这个术语还没有用来描述植物表面上细菌的生长。在生物膜这个结构功能区里，生命相对于单个细胞来讲具有很多优势，如免于遭受大量的环境胁迫——紫外线辐射、干燥、降雨、温度变化、风和潮湿。生物膜也增强了微生物对抗菌剂(指由相互竞争的微生物或宿主的防御系统产生的抗菌性物质)的抗性。
图6.生物膜从几个方面获得了它们对抗菌化合物的不寻常的耐受性。菌落中心附近的细菌生长得非常慢，这是因为它们被暴露在较低浓度的氧和营养物质的环境中(如图中1)，因而它们受抗生素药物的影响小(抗生素药物对快速生长的细胞要有效得多)。细胞间的信号(如图中2)能改变生物膜的生理学机能，导致细胞产生分子泵，这些分子泵会把抗生素排除在细胞外，并且允许菌落甚至在药物存在下生长。生物膜粘质是带负电的(如图中3)，因此它结合到带正电的抗菌剂上，就会阻止抗菌剂到达菌落内部的细胞。特化的“顽固细胞”(persister cell，如图中4)群在抗生素存在的环境中不会生长，但也不会死亡。当药物效力解除后，顽固细胞能长成正常的细菌菌落。这个机制被认为是造成医疗机构中周期性发生感染的原因。最后，群体的多样性(如图中5)，即遗传的和生理的多样性充当了“保险单”，提高了一些细胞经受挑战后依然存活的机会。
图7.热带假丝酵母(Candida tropicalis)，一种导致阴道炎、鹅口疮和心脏感染的酵母，它形成了对抗真菌剂和抗菌剂有高度抗性的生物膜。这个图像是使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)得到的。CLSM是一个新的装置，能够提供组成生物膜的微生物小菌落的快照。
植物和生物膜之间的关系并非千篇一律。在一些例子中，植物仅仅作为一个机械支撑，生物膜就可看作无害的附生植物；而在另一些例子中，植物可以为微生物提供一些营养物质，例如以植物的腐生物质为生的腐物寄生菌。这些对植物都是无害的，但是具有引发与宿主的病原相互反应的遗传潜能的某些附生植物种群，其生长至一定数量时就会压倒宿主的防御机制，这样就会造成麻烦。此时，生物膜中的细胞就会互相配合释放出毒素和酶来降解植物组织。结果，开始时是无害的相互关系最后以疾病而告终。
在地下，植物和生物膜的相互关系可能也是非常精细的。例如，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) “驻扎”在植物的根部，通过产生抗生素使植物免受病原菌侵袭，而且将真菌和其他细菌移入者排斥在外。但是，真菌的生物膜也可能对植物是有益的。某些菌根真菌(mycorrhizal fungi)可以穿透植物的根细胞，在土壤中形成一个很大的网络；因而它们能使植物根部的表面积剧增，植物正好利用这一点来吸收水分和营养物质。
另一方面，根瘤菌属的细菌能够从大气中固氮——将氮气转变成氨。这个过程包括一些错综复杂的植物和细菌之间的化学信号，这些信号导致了根瘤的形成，而根瘤是细菌集合体固氮的场所。或许最复杂的关系涉及根瘤菌、菌根真菌和植物宿主三者之间的相互作用。细菌在真菌表面形成生物膜，真菌与植物建立了联系，这样就确立了一个三者共生系统(细菌-真菌-植物)。这个系统依靠2类微生物(细菌和真菌)形成生物膜(如果土壤不是碱性的，则该系统还需要另一个参与者，即氧化氨的硝化细菌；硝化细菌不生活在根瘤上，但在其附近的土壤里)。
最后，让我们考虑一下植物导管系统内部生物膜的病原相互作用。不幸的是，导管的疾病目前还无法治疗，它对许多有经济价值的重要作物造成了巨大破坏。在植物运送水分的木质部里的几种病原生物膜已被研究，但这里我们将仅谈谈苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。这种病原菌导致了葡萄藤和柑桔产生杂色退绿、甜橙发生萎黄的皮尔斯病(Pierce's disease，Xylella fastidiosa生活在植物传送汁液的木质部内，主要是通过阻塞植物体内输送水分和养分的导管而最终导致植物死亡——译者注)。这种病已经对加州的葡萄酒工业和巴西的柑桔产业产生了巨大影响，经济损失在过去的10年里超过了140亿美元。皮尔斯病也限制了佛罗里达州葡萄酒工业的发展，因为这种细菌在该州是特有种。
Xylella fastidiosa是由以木质部为生、属大叶蝉科的昆虫(俗称“神枪手”)传播的。当该类昆虫吃被感染的植物时，昆虫就获得了Xylella fastidiosa。这种细菌在昆虫肠道内形成基本的生物膜，这就允许它们可以聚集体的形式被不确定地抛弃；当形成的聚集体足够多时，聚集体就可以感染另一株植物(当昆虫吃另一植株时)。反之，生物膜阻塞了植物的木质部并导致了与水分输送有关的症状。因此，生物膜在植物导管被侵占、疾病传播和致病性方面起到关键作用。
评价生物膜在植物疾病中的重要性才刚刚开始，也许将这种新的理念应用于植物微生物学要花费一些时间，但收益可能是重大的。更好地理解植物和生物膜二者之间的联系，可能会产生更有效的、对环境更友好的治病方法；也可能会发展出商业上的应用，这些应用能够增进植物和微生物之间有益的相互作用。的确，各种各样的根瘤菌现正作为生物肥料用在农场里。
综合我们的研究成果
美国疾病控制和预防中心估计，生活在西方国家人类的细菌感染70%是由生物膜造成的。其中包括前列腺炎、肾脏感染、与植入体内的医疗装置(如人造关节、导尿管)相联系的疾病、牙科病(牙腐蚀和牙龈疾病)等。牙科病是由牙垢引起的，牙垢是一种生物膜。在囊肿性纤维化病人的肺中，绿脓杆菌常常形成可引起潜在致死性肺炎的生物膜。跟生物膜有关的疾病可列出一长串名单，并且许多科学家认为，随着对这些微生物结构和功能的不断了解，这个名单还将继续增长。
在几乎所有的例子中，生物膜在帮助微生物存活或在宿主内传播方面起到了中心作用。这是因为，那层粘糊糊的物质(即上面提到的“粘质”)就像一个盾牌，保护病原菌免受抗体和血液中白细胞的攻击(白细胞是免疫系统的“哨兵”)。生物膜还以具有抵抗很高浓度的抗生素的能力而出名，而较小剂量的抗生素对生物膜中的浮游细菌就是致死的。事实上，生物膜对抗菌剂的敏感程度只有悬浮液中同样微生物的1/10～1/1000。
同病原菌的战斗具有重大意义，这个巨大的挑战一直是研究的焦点。目前已经在加拿大成立了一家公司，并得到许可使用一项新技术(卡尔加里生物膜装置，现在称为MBEC测定法)，它被用来快速筛选生物膜对抗菌剂的敏感性。现在药物实验室对治疗肺炎或与导管有关的感染的潜在药物进行的检验，旨在发现对自由浮游的病原菌有效的药物是否也能成功地根除生物膜中的同种病原菌。
我们仍在探索一些致病性“共生膜”，即有些不相关的物种也在膜中生活，这些特殊的机制在研制药物中可能是非常重要的。例如，生物膜对较高的金属浓度的抗性，使其在去除环境中有毒金属方面颇为有用。但详细了解了生物膜是如何解除金属毒性的，也有可能开启一扇研制抗生物膜的疗法之门。
一些研究者已经知道，细菌具有不同寻常的“弹力”部分是因为在生物膜内有很显著的不均匀性。最靠近包围生物膜的流体的微生物，同处于基质中心或附近的微生物比较起来，接触氧气和营养物质的机会大一些。结果，菌落外层的细菌比菌落内部的细菌生长的快得多。这种情况作为一种防御机制就开始起作用了，因为许多抗生素仅对快速生长的细胞有效，因此，生物膜内生长慢的细菌就有逃过抗生素作用的趋势。而且，菌落中心的细胞受到更好的保护，因为生物膜粘质是带负电的。这就限制了带正电物质的进入，例如金属离子和某些抗生素。
在形成生物膜所产生的防御机制中，最令人感兴趣的机制之一是一种被称作“群体感应”(quorum sensing)的细胞间的信号作用——一些细菌会释放一种信号分子或诱导物。随着细胞密度的增加，这些分子的浓度也会增加。诱导物分子与每个细胞中的专一性受体相互作用，以打开“群体感应”基因并开始一系列事件，引发细菌染色体上大量其他基因的表达或抑制。一些细菌菌株似乎比另一些菌株更多地依赖“群体感应”，但是无论何处，一个微生物基因的1~10%可能都直接受到这个过程的调控。
科学家现在知道，群体感应影响了涉及细胞修复和防御的酶的产量。例如，在绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(H2O2)都受到群体感应的调控；Pseudomonas aeruginosa形成了包埋在细胞碎片中的细胞类粘蛋白束，这些细胞碎片来自囊肿性纤维化病人肺中的呼吸道上皮层。SOD促进了有害的超氧自由基(O2)消失，而H2O2酶将有毒的H2O2分子转变成水和分子氧。这些酶有助于生物膜经受住消毒剂和宿主免疫系统细胞的攻击，宿主免疫系统细胞通常通过释放抗菌剂(包括活性氧)来杀死细菌。
群体感应也可能与防御抗生素药物有关。在这里，这种机制增加了分子泵的产量，而分子泵可以将化合物排除在细胞外。所谓的“多药物外排泵”(multidrug efflux pump)减少了细菌内部抗生素的积累，甚至允许细菌在药物存在下生长。
生物膜中各种细胞类型的不均一性也有助于对抗菌剂的耐受性。特化的幸存者细胞(被称为“顽固细胞”)，是存在于每一个细菌种群中的缓慢生长的变异体。在遗传上，它们被“编程”以经受各种环境胁迫，包括暴露在抗生素的环境中。尽管“顽固细胞”在一种抗生素存在的情况下不生长，但它们也不死亡。“顽固细胞”不是突变体；即便在遗传背景一致的细胞群体中，亦有一小部分经历这个向“顽固细胞”的自发转变。去年美国东北大学的凯姆 · 路易斯(Kim Lewis)证明，“顽固细胞”产生了一种叫做“RelE”的毒素，这种毒素驱使细菌细胞变为休眠状态。一旦抗生素的效力终了，“顽固细胞”就会长成新的细菌种群，从而导致生物膜感染的复发。
使用“顽固细胞”作为一种防御机制可能是在生命历史早期进化出来的。在这个后基因组学时代，科学家们已经知道在很多种相关性很远的细菌中存在着很多相关的基因，表明了这些相似的基因存在于原始的共同祖先中。然而，“顽固细胞”的生长速率却降低了，这似乎形成了一个悖论，因为细胞分裂变慢就会降低一个群体的适合度。
洛克菲勒大学的伊多 · 库斯尔(Edo Kussell)和其同事近来提出，细菌的顽固性或许是作为抵抗稀有抗生素的“保险单”而进化出来的。假如这样的话，在试图征服细菌对抗生素耐受性的较量中，科学家们是正在同一个古老的机制战斗，这个机制可能在几百万年的时间里一直在不断地优化自己！如果我们成功地控制住了细菌感染，那么今后我们需要把更多的研究精力聚焦在生物膜上，而不是相对脆弱的浮游形式的细菌。
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观察微生物的一个新方法
培养细菌的常规方法就是，把细菌接种到一个盛有肉汤营养物的烧瓶中；如果你不停地摇动肉汤，细胞就会得到充足的氧气和均匀的营养物分配。在这些最佳生长条件下，你将获得一批很好的漂浮在溶液中的自由浮动的细菌。
当然，自然界很少能提供这种完全均匀的环境。生物膜中的细菌生活在由不均一的微环境组成的基质中。微环境中氧气含量、营养物质分配和其他数不清的化学变化因素都是不同的。粘在实验烧瓶内壁上的细菌形成了成熟的生物膜。具有讽刺意味的是，直到近来这些生物膜还是大部分被忽略或毁坏了。
为了在实验室培养和检验生物膜，已经明确发展了几种新技术。一个方法是在接种肉汤里放置旋转圆盘。旋转产生的剪切力能促进盘上生物膜的形成。一研究小组近来研制了一种生物膜测定法，它是以高通量的方式检验抗菌剂的有效性，即这个装置允许我们一次制备出96个统计上的生物膜，它也能用于检验各种抗菌化合物的洗脱情况(要用到一个标准微量滴定板和MBEC测定法)。目前正使用这个工具来发现有效抗生物膜的新物质。
另一个装置叫做流动式细胞仪。它由一个腔体和一个光学透明表面(如玻璃盖玻片)组成。通过生长介质被泵入腔体后，这样可促进玻璃表面上形成较厚的生物膜。这种方法允许科学家使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)来检验微生物群落。专用的计算机软件被用来剪辑CLSM捕获的图像，最后可做出生物膜的三维图。
CLSM可被认为是扫描电子显微术(SEM)的补充。SEM能达到的放大倍数是CLSM的10倍，因此SEM能被用来研究单细胞的形状和排列情况，而CLSM能提供生物膜结构的一览图；SEM杀死了微生物群落，而CLSM没有侵害性。所得图像的结果可以被编辑成电影，以便显示出微生物在生物膜中是如何生活及死亡的。
最后，在蛋白质组和转录组中开创的新方法允许科学家们来研究生物膜中蛋白质的分布及模式和基因表达情况，这些技术的发展已经打开了一扇了解微生物是如何生存的新视角之门。
上图是由使用共聚焦激光扫描显微术获得的“切片”集合成的，这些图像提供了一幅详细的细菌生物膜结构图。这是实验室培养的大肠杆菌(E.coli)的生物膜，通过把一个荧光蛋白基因拼接到大肠杆菌DNA上，才使我们能看清楚其结构。