二十多年来，布莱恩·科比尔卡（Brian Kobilka）埋头苦干，想要对一个关键的细胞受体进行描述。有时候，进展却是缓慢的，而踏踏实实的方法可能更胜一筹。

科比尔卡，对GRCRs本性狂热，一心只想弄明白它们的结构

　　去年五月，布莱恩·科比尔卡（Brian Kobilka）走下中国飞往旧金山12个小时的红眼航班，已经筋疲力尽。但在家稍作小憩，他便径直回到机场，将自己魁梧的身躯塞进另一架航班，飞往伊利诺伊州的芝加哥。之后，他驱车前往阿贡国家实验室的先进光子源：用于分析蛋白质结构的功效强大的X射线束源。科比尔卡，斯坦福大学的生物化学家，迫切地要看到他实验室对关键的细胞表面受体第一个原子规模、三维形象的最新数据描述。这一图象标志着约二十年前他开始的一趟学术旅程已经走到最后一步。
　　从视觉和嗅觉到心跳频率以及神经通讯，几乎人体所有的功能都依赖于G蛋白偶联受体（GPCRs）。它们多位于细胞周围的多脂肪的细胞膜上，能够探测荷尔蒙、气味、化学神经递质，以及其他细胞外的信号，从而将信息通过激活不同类型G蛋白中的一种传递到细胞内部。转而，G蛋白引发各种生命活动。各种受体构成了人类蛋白质最大家族中的一员，也是三分之一到一半药品的靶标。弄清楚它们的原子结构将能帮助研究人员理解这一主要细胞通讯系统的工作原理，还能有助于药品研发人员设计更高效的治疗方法。
　　因为人们普遍认为蛋白质太复杂，很难像晶体那样保持稳定，而稳定是用X射线晶体学进行结构分析的一个前提条件。然而他的执着终于开始有所回报。2007年，他领导的团队首次做出了与荷尔蒙连接的GPCR的高分辨率结构图。今年1月，他又一次对激活G蛋白的受体做出了同样的高分辨率结构图。7月，他公开发表了世界上首个G蛋白和GPCR复合物的结构图。
　　诺贝尔奖评选领域里成果频频，“但是如果他们真的把奖发给布莱恩，把他弄到斯德哥尔摩会很困难”，加州大学名誉教授亨利 ·伯恩（Henry Bourne）这么说，他的研究方向是G蛋白质，从上世纪八十年代开始就与科比尔卡相识。科比尔卡不喜欢成为众人瞩目的焦点，在圈内他因羞涩、谦逊的品质和能破解看似无法解决的蛋白质结构的才华而著称。我在斯坦福的办公室与他见面的时候，他快速地和我握手，低垂着眼帘，犹豫了一下还是让我坐在他办公桌对面的一张椅子上。他紧张地盯着我手里录音笔上的显示开机的红光。他自己说，面对媒体他是“真的非常害怕”，嗓音不像平时那样自然流畅，而他之所以接受采访，按他的话说，是因为“想确定我的实验室和同事们的贡献得到了公众的认可。”
　　其实，他的确紧张，想从他那套出些什么几乎很难。当问及为什么他对GPCRs如此着迷，科比尔卡想了想，挤出一个回答：“我生来就被这些蛋白迷住了。我说不清楚。我只是想知道他们是怎么回事。”唯一看他状态放松下来是他在描述与G蛋白融合的受体的构造的时候。“这个结构太美妙了。美轮美奂。说说这结构，我非常高兴。”他说着，脸上掠过一丝笑容。
　　伯恩说：“布莱恩这个人让人着迷。他非常有野心，极富热情。但他不会让你感觉到自我张扬、一意孤行和高调炫耀，其实这些他都没有。他只会让人耳目一新。”
　　也许正是科比尔卡少有的沉默寡言和坚定执着才使他找准合适自己的蛋白结晶任务，最终得到一个完整的原子结构，这中间没有得到什么回报。伯恩说：“他所做的一切，一步一个脚印，直到成功。”

烘烤世家的生物学

　　科比尔卡出生在明尼苏达州中部的一个很小的乡村。他的祖父和父亲都以烤面包为生，母亲专门装裱蛋糕。科比尔卡在明尼苏达大学学习生物和化学，在那儿的生物课上，他遇见了后来的太太田桐荪（Tong Sun Thian，音译）。她说：“他当时总是在班上名列前茅，但非常低调，你想象不到的。”
　　当科比尔卡和他夫人在学校的生物实验室一起共事时，他初尝科研的滋味，当时他们一起用父亲面包房里的边角塑料为实验室建了一个组织培养箱。他热爱研究，但选择了去医学院，他说，在明尼苏达的乡村，喜欢生物的人都当医生。在康涅狄格州耶鲁大学学习期间，科比尔卡对重症监护医学和对GPCRs起作用的生死关头使用的药物产生了兴趣，尤其是肾上腺素和去甲肾上腺素的受体，它们的作用是打开气管，促进心率。
　　1984年，科比尔卡在医院的实习期结束后，向北卡州的杜克大学的罗伯特 ·莱夫科维茨（Robert Lefkowitz）申请奖学金。这是当时研究肾上腺素受体的实验室中最好的一个，肾上腺素是所有荷尔蒙受体的一个模式系统，从而成为研究对象。科比尔卡加入之后，实验室开始考虑如何克隆β2肾上腺素能受体（β2AR）的基因，并确定其基因序列。但由于受体的量太小，试验小组收集到的蛋白质只够零星地解出一点点可能的基因序列片段。用莱夫科维茨的话来说，科比尔卡接着表现了“他无数技术革新光芒中的第一次”。科比尔卡决定建一个哺乳类染色体基因序列的图书馆，用已有的次序片段筛选。这会将克隆的时间拉长，所有的克隆拼接起来展现出完整的序列。
　　这个计划成功了。当研究小组将受体的次序连接起来，结果让人大吃一惊：主要出现在细胞膜中的氨基酸，有好几串显示受体在细胞膜中蜿蜒穿梭了七次。这就好比视网膜紫质，这种视网膜里的测光受体可以激活G蛋白。那个时候，没理由相信这些受体会看起来一模一样，尤其是当其中一个受到光线的刺激，而另一个受到荷尔蒙的刺激。
　　“那真是如阿基米德高呼‘找到了’的时刻。”莱夫科维茨回忆道。那时，大约发现了30种G蛋白。“我们明白，天啊，它们会都像这样的。这是一个完整的家庭。”
　　然后人们知道这个家庭有七个跨膜受体，或者叫GPCRs，现在又知道在人体中有将近800个家庭成员。科比尔卡谦逊地描述了起着转折作用的克隆计划。他说：“投入这个项目让人很激动，这是莱夫科维茨实验室里很多同行们努力工作的结果。”
　　有时候，低调谦逊也会给科比尔卡带来麻烦。他从杜克毕业后，去加利福尼亚大学药理学系申请教师工作岗位接受面试。时任系主任的伯恩说：“我们当时留了他和另一个家伙，大家都看得出来布莱恩很聪明，没什么问题。但他一点也不活跃，害羞、柔弱、看起来像北欧来的家伙。我当时想，这家伙是谁？非常与众不同，低调又很安静。”
　　结果另一个家伙被录用，而科比尔卡被斯坦福抢走了，伯恩说：“我们当时真应该把他俩都留下来。”

发现新大陆

　　科比尔卡成功解出β2AR之后，在研究上更加入迷。他想弄明白用X射线晶体学在三维状况下受体看起来是什么样子，要做的就是用一束X射线投射在一个蛋白晶体上，晶体的合成衍射图样用来显示其原子的排列。这是一个大胆的目标。为了获得清晰的X射线衍射图样，科比尔卡首先需要将受体结晶，将成千上万个相同的蛋白紧压在一起让它们看起来像显微镜的玻璃碎片，这个过程相当艰难。要创造出让一个蛋白结晶的环境需要花上几年的时间，而且像GPCRs这样的膜蛋白是所有蛋白中最硬的：必须将它们完好无损地从细胞膜中剥离，但就是细胞膜才使得它们有着各自的外形。GPCRs还经常不断地改变各种各样的状态，大多数显示少量性状。为了收集足量的蛋白，科比尔卡需要使β2AR产生100－1000倍的基因效应，这个水平一般在一个细胞里能够产生。那时候，没人能够做到将GPCR晶化，而尝试去做的人也屈指可数。

GPCR（蓝色）被一个信号分子（黄色球状，顶部）侵入并激活了一个G蛋白（红色、金色和绿色）的分子图

　　受体晶化成了科比尔卡的最钟情的计划，因为他觉得这对于一名研究生或博士后来说风险太大。“我们以往开玩笑，他教完课或开完会，手里拿着个圆柱就冲进实验室，想做一个结合测定，看看他最新的提纯能不能在回家之前完成。”科比尔卡的第一个博士后，现在加州大学研究GPCR运输的马克 ·冯 ·扎斯特洛夫（Mark von Zastrow）介绍说。科比尔卡有理由去匆匆度过一周的工作日，他有两个年幼的孩子，夫人在医学院工作，他们需要支付“高额的”房贷。为了支付家里的开支，他得在周末去急诊室做兼职医生。冯 ·扎斯特洛夫回忆当时拿科比尔卡那项似乎做无用功的结晶研究项目开玩笑。“他告诉我们，‘你们看着。晶体会很大。我打算用它们给桐荪做一个戒指。’”
　　一年一年过去了，科比尔卡的实验室进行了各种各样的生物化学和生物物理试验，都是为了能更透彻地弄清楚β2AR，他本人也在表达和提纯蛋白方面不断取得进展。但在解出蛋白结构的工作上他还没有明显突破。伯恩说：“人们看得出来他当时做事一丝不苟。他不在那些花哨的必威体育备用地址 上发表文章。”研究小组认为，GPCRs在细胞的内外都有很大的、松散的环结，受体不断扭动，承受各种程度的激活作用。这项工作只能使晶化过程看起来更加遥不可及。
　　与此同时，另一项GPCR结晶也在紧锣密鼓地进行。2000年，西雅图华盛顿大学的克日什托夫 ·帕尔切夫斯基（Krzysztof Palczewski）和他的博士后冈田哲二（Tetsuji Okada）发表了在视网膜中的感光GPCR，视网膜紫质的晶体结构。这是一项相当重要的成就，但对科比尔卡来说没有太大作用。视网膜紫质有很多，从屠宰场弄一些奶牛眼睛就可以为结晶找到足够的纯蛋白。这比其他GPCRs更简单，更稳定，而且其结构也是不一样的。
　　2001年，科比尔卡得到了令人沮丧的消息。他从马里兰州霍华德休斯医学研究所得到的主要科研基金到2003年用完后将被终止。他的实验室开始为科研经费奔波，为了继续他那项耗资巨大的晶体化试验甚至负债累累。科比尔卡自己说：“我没想过要放弃。我承认有时候有挫败感，但我喜欢挑战，我想知道答案。”科比尔卡提到，他的一个朋友“将我的固执形象地描述成‘失去理性的乐观’”。
　　终于，在2004年末，他的研究小组成功地培养了一些小晶体，太小了，用斯坦福的同步辐射设备没法分析。当时在剑桥医学研究理事会的分子生物学实验室工作的晶体学专家格布哈特 ·舍特勒（Gebhard Schertler），建议科比尔卡将他的样本拿到位于法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射装置（ESRF）进行检验，那里有聚焦度极高的光束可以分析如此小的晶体。“我们那时候一直没有资金。”现在瑞士保罗谢勒研究所工作的舍特勒告诉我：“所有的测量都是用我的补贴。”在大约20埃（光谱线波长单位）的分辨率下晶体产生衍射，分辨率太低，无法得到可以辨别的图象。要看到单个原子的组织结构需要大约4埃的分辨率。
　　尽管如此，科比尔卡说，“形势还是令人振奋。一部分原因是我本人非常天真。我想我们能够很快达到3埃的分辨率。”他最终在晶化项目中招收了几个博士后。2005年，他还收到了一笔救命钱，从马里兰州的美国国立卫生研究院赢得两项基金。但不幸的事随之而来，研究小组无法获得更大体积或衍射更好的晶体。受体多变的激活状态和松散的片段，尤其是在受体的细胞内侧一个多变的环，使得在相同构造下抓取所有蛋白变得十分困难。研究小组明白，他们必须有魄力：切断松散的枝节，或者把环固定在一个抗体的位置或者用某种利于晶化的蛋白来替代。
　　由博士后瑟伦 ·拉斯姆森（Soren Rasmussen）带头的抗体研究项目第一个参与合作。他们首先将晶体送给谢勒。谢勒说：“这是最棒的东西。布莱恩和我，还有我们的小组都在做同步辐射。我们坐在机器前测量数据。当我们第一次看到3.5埃的分辨率，房间里所有的人都兴奋地跳了起来。这是个幸福的时刻。那才是推动科学家前进最重要的东西。那一刻，我们明白我们发现了新大陆。”这个结构出版在《自然》杂志上，是继视网膜紫质之后第二个GPCR的晶体结构图。
　　然而，科学家们收起了蛋白复合物的项目给他们带来的荣誉。博士后丹尼尔 ·罗森鲍姆（Daniel Rosenbaum）发现，T4溶解酵素（T4L）这一蛋白看上去有可能可以与受体结合替代环。科比尔卡与位于加州拉荷亚的斯克利普斯研究所的雷 ·斯蒂文斯（Ray Stevens）、他新招收的博士后瓦迪姆 ·切列佐夫（Vadim Cherezov）取得联系。瓦迪姆一直在优化一个多脂肪支架用于锁住膜蛋白质用于晶化。T4L和多脂肪支架最终成了获胜的结合。就在《自然》杂志发表论文没几天，科比尔卡和斯蒂文斯紧接着又分别在《科学》上发表文章，展示他们2.8埃下β2AR的结构图。

迷人的结构

　　三篇文章的发表为结构生物学竖起了一个里程碑，也使得这一原本已经发展迅速、锐意进取领域的竞争更加白热化。斯蒂文斯成为了其中一位竞争者，他的实验室现正全力以赴，进军更前沿的GPCR结构研究。
　　但科比尔卡心里却有着另一个目标。GPCR结构在不活跃的状态下只是受体的简单印象。要想真正理解受体的属性原理，研究者们需要看到它被配合基激活并与G蛋白结合的情况。与前一个项目相比，这一项目在技术上的难度更大。蛋白复合物太大无法支撑脂肪支架；G蛋白不停地减少；而且受体细胞外的部分在晶化过程中会发生变化。科比尔卡说：“实在太难，我不确定我们是不是能成功。估计这可能是我的退休项目了。”他也知道，还有几个其他的实验室，特别是那些研究视网膜紫质的实验室，在这个领域紧追不放。
　　科比尔卡竭尽全力向各行各业的专家们寻求帮助，其中包括密歇根大学G蛋白的研究专家砂原罗杰（Roger Sunahara）。各色研究小组研发了一种清洁剂，用于恒定受体和G蛋白，恒定能够支撑这个复合物的液态支架；以及能控制这个局面的抗体。拉斯姆森坚持不懈，检测了成千上万次的晶化状态和方法来研究蛋白。
　　去年五月的一个早上，科比尔卡瞟了一眼拉斯姆森研制晶体的显微镜。“那些晶体比我们培养的复合物晶体要大。让人相当高兴。我不知道它们会不会顺利地衍射，但我感觉非常好。”科比尔卡回忆说。但是计划去中国的行程意味着他无法亲自等着看到第一个X射线的图象。他的夫人桐荪说：“我们一到北京的酒店，他就迫不及待地上网。”当他得知问题解决的时候，“他狂喜，你能看出来他是真的想马上飞回去。”
　　分辨率达到3.2埃的新图象显示了一个纠缠在一起的分子的三个层面：一端是有配合基的β2AR，另一端是G蛋白。田纳西州纳什维尔的范德堡大学结构生物学家恰克 · 桑德斯（Chuck Sanders）表示：“这的的确确是一场竞争，在我看来，科比尔卡胜利了。这个领域发展前景好。复合物就是他们获得的奖项，现在已经胜券在握了。”
　　当然，科比尔卡将荣誉归功于他的同事们和他实验室里的“幕后英雄”，他希望每个人都能在报道中看到他们的名字。他对受体的热爱一如既往。他说：“我们对这些蛋白了解得越多，就越显得它们更复杂更迷人。
　　在此基础上，他对更多的并发症有了了解：受体的不同激活状态是什么样，为什么不同的受体组合不同的G蛋白，当不同的配合基与同一个受体结合会发生什么。他也运用不同的技术，比如电子显微镜和核磁共振，来更好地弄清楚GPCRs是如何弯曲并移动的。“工作还没有进展。”
　　也许没有，但很少有谁会怀疑科比尔卡做不成。莱夫科维茨就说：“布莱恩最终会胜利到达他的目的地，实现他的目标。有时候会花上15年，但他成功了。”

资料来源Nature

责任编辑 彦 隐

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本文作者莉齐·布臣（Lizzie Buchen），加州旧金山一自由撰稿人。