单个神经元的电压记录或将推动下一次神经科学革命。
2010年，生物物理学家亚当·科恩（AdamCohen）漫步于加利福尼亚旧金山时，接到一个意料之外的电话：“我们捕捉到信号了！”电话的另一端在5000公里之外的马萨诸塞州坎布里奇，是他的合作者一铲挖到了宝藏。在实验失败了几个月后，研究者终于发现了一种荧光蛋白，可以反映信号在神经元间的传递。
但出了件怪事。当科恩回到哈佛大学的实验室，他发现所有实验中的记录都呈现出一种奇怪的趋势。最初，蛋白修饰的神经元都在电冲动一闪而过时发出闪光。但接着，细胞就持续发光，形成了明亮的斑点。“每次记录到一半时，信号就像发了狂一样。”科恩说。
因此他决定和他的团队一起进行一次实验。“当记录开始时，他们紧张地屏住呼吸，”科恩说，“接着实验成功了，他们开始庆祝，绕着屋子边跑边跳。”
在他们兴奋地庆祝时，桌上的台灯正巧照到了显微镜上。“我们其实记录下了我们的兴奋。”当时科恩团队中的一个研究生丹尼尔·霍克巴姆（DanielHochbaum）说。欢呼声渐渐平息，一年后，科恩的团队发表了研究成果——修饰哺乳动物特定神经元的荧光蛋白能够用于实时记录单个神经元的电冲动。他们是最先发表这一成果的研究团队之一。
神经科学家多年来一直在尝试记录转瞬即逝的神经元电信号——脑活动的主要内容。尽管电极作为可靠的电压测量手段能测定单个神经元的活动，却很难在神经元数量和记录时间上有所突破。过去的20年中，科学家发现了向神经元细胞膜上植入可指示电压的荧光蛋白的方法。在特定的显微镜下，细胞便显露出它们间的对话来，或是一丝低语，或是一声呼喊。电压图像还能够同时记录一大片神经元间的“对话”，并以某一区域的脑组织作为单位将信号进行平均化计算。这可以帮助研究者以空间尺度研究大脑的电活动，仅仅聆听一个神经元的声音无疑无法做到这一点，我们需要记录的是科恩比喻的“众人的喧闹声”。
过去5年中，科学家发表了大约1000篇这一主题的论文。同时，几个大型的资助计划，像美国国立卫生研究院的“脑计划（BRAINinitiative）”，加速了一些新型基因工程电压指示器的发展。为了找到更好的方法，一些课题组甚至提出对数百万的蛋白进行筛选的策略，希望以此来找到具有一定特性，比如具有一定亮度的发光蛋白。其中一个课题组成功地鉴定出一种指示蛋白，相比4年前研发的类似指示系统，具有两倍的亮度。
这些蛋白不断进步的同时，显微镜技术的发展也使人们得到更清楚的图像，科学家希望以此解决神经科学最大的谜团：脑中的细胞是如何共同运作将电信号转换为思想、行动和情感的。研究者仍然希望可以捕捉到全范围的脑活动，并试着设计出新方法来观察脑组织内快而深的神经冲动。如果这些技术难题被攻克，纽约市哥伦比亚大学研究神经环路功能的拉斐尔·尤斯特（RafaelYuste）指出：“这将是革命性的。”
高速进程
人脑平均约含1200亿个神经元，它们无时无刻不在运作着，通过树突等树枝状突起接收和发出信息。到达树突的化学或电信号使树突的细胞膜产生微小的电位变化，并传至胞体。当电位的改变到达所谓的“阈值”后便不再恢复，神经元膜上将激起一个巨大的峰电位，即动作电位。这一电位将沿着神经元突起中的轴突，以每秒150米的速度传递至另一组树枝状突起。并于此通过化学或电信号将信息传递至周围其他神经元的树突。
神经元信号汇聚、分散并同步化，奏出思想、情感、行为和反应的交响曲，从害羞时的面红耳赤，到新生儿的打嗝。但科学家聆听这首乐曲的手段相当有限。最初于20世纪40年代，科学家用细如发丝的微小电极插入脑中，置于神经元的表面或内部，以此精确而又快速地测量到细胞膜上的电位。但这一方法的局限在于只能同时测量一个或少数几个神经元，也只能维持有限的一段时间，毕竟电极终将破坏细胞。这正像是只给人听交响乐团中的一个演奏者几秒钟的演奏，却让人从中领会到整首交响乐的编曲精髓所在，只能说是管窥蠡测。
成束的微电极可以同时记录超过200个细胞的电活动，但由于这些电极被置于细胞膜外表面附近，而非细胞膜内，只能检测到电活动中最剧烈的电位变化——动作电位。它们听不到那些乐曲中弱音——那些微小而不引起动作电位的电位变化。但这些阈下电位变化却至关重要，是它们的逐渐累积确定了神经元何时会产生动作电位。
为了在更小的电活动程度和更大的数量上进行测量，20世纪60年代，科学家开始设想是否可以设计一种感受器或探针，在电信号的作用下能够发出荧光。最常用的探针是钙指示剂，当电活动产生峰电位时，钙离子流入神经元，而钙指示剂在结合钙离子后发光。但钙离子成像这一技术仅仅能间接反映细胞电活动，并不能直接记录细胞膜电位。同时，尽管它能记录动作电位这种较为剧烈的电位变化，仍然对微小的膜电位变化或抑制了动作电位的电信号充耳不闻。这又如同是仅仅听到交响乐结束后的掌声震耳欲聋，显然演出这一事件发生了，但演奏内容不得而知。
20世纪70年代，科学家开始研发能够直接检测细胞膜电位变化的染料传感器。最初的染料必须被无差别地涂布于整个脑组织，因此所有种类的细胞都被标记了，那些同样被标记的非神经元细胞，就使解析特定的神经元电活动变得很困难。
到了90年代，研究者开始尝试能够通过基因工程技术表达于特定神经元的指示器。第一个基因编码电压指示器（geneticallyencodedvoltageindicator，GEVI）于1997年问世，这之后，许多研究者如法炮制，研发得到了超过20种传感器。其中有些是通过将电压敏感蛋白同荧光分子相结合（见上图“多种多样的荧光”）。当这些蛋白在检测到电位变化后，三维结构发生变化，结合分子的荧光进而发生变化。另一种传感器则是微生物视紫红质的突变体，这是一种在光照条件下可使质膜电位发生变化的荧光分子。它也可以反其道而行之，在膜电位变化时，改变其荧光。
细节决定成败
至今为止，GEVIs已成功在实验室培养皿中的神经元细胞和从昆虫到小鼠的许多种动物的完整大脑中，记录了单个动作电位。这一技术最有前景之处在于它有可能实现记录膜电位除了剧烈电位变化之外的、微小的阈下变化，以此反映出神经元细胞从周围细胞中接收到的讯息。科恩说：“电压成像让人们看到体内神经元的输入信号，这在以前如同是天方夜谭。”
在过去一年，科恩和他的同事们开发了新的GEVIs，并改善了显微镜技术，使同时记录大量神经元的阈下电位变化成为可能，并在小鼠脑内进行了实验。他的团队同时实现了记录同一神经元最多一周后的电活动。“确切了解实验中记录了哪些神经元，并长期跟踪它们的活动，让研究者有机会了解到神经元间的连接，”麻省理工学院的神经科学家艾德·博伊登（Ed Boyden）说，“通过这种方法，就可能将脑的结构与功能联系起来，这是神经科学领域中的核心问题之一。”
GEVIs的另一个优势在于，它不同于电极主要从细胞胞体处记录，而能够从神经细胞的任意部位记录电信号，从胞体一直到树突末端（见下图“直击多尺度”）。这如同是能够直接听见钢琴家左手弹奏的音符。“这是我多年来的梦想，自然我也绝非一人，”加拿大魁北克省拉瓦尔大学的神经生物学家凯特琳·托斯（Katalin Toth）说，“许多神经科学家都努力通过追踪神经元整体的电压变化，来研究电压在细胞不同区域内的变化。”
伊利诺伊州芝加哥大学的神经生物学家魏巍正使用GEVIs研究不同的电输入信号是如何在小鼠视网膜神经元内被整合的。魏巍的研究兴趣涉及一类能够对一定方向运动的视觉刺激产生强烈反应的神经元。通过观测这些神经元不同部位膜电位的变化，她希望可以理解细胞如何处理输入信号，以探测刺激的运动方向。
巴黎高等师范学校的神经生理学家文森特·维莱特（VincentVillette）利用电压传感器研究阈下电信号的周期性波动如何影响小鼠小脑神经对肌肉活动的协调。维莱特表示：有关细胞如何协同运作，我们还知之甚少。
如果能够直观地读出细胞的膜电位，那么科学家们就可以对抑制神经元活化的电信号进行研究，而不是仅仅将研究局限于激活信号上。法国马赛港地中海神经生物学研究所的神经生物学家罗莎·柯萨特（Rosa Cossart）指出：由于钙离子成像等方法无法记录抑制性信号，我们并不清楚这类型号是如何影响脑活动的。
柯萨特长年以来使用电极和钙离子成像作为实验手段，如今她很希望试试GEVIs。她希望这些传感器能帮助她在同一时间测量到活小鼠的多个神经元间——至少50个——高速传递的电位变化。“这将有利于理解一组组神经元是如何整合电信号——无论兴奋性还是抑制性信号——来支持对脑发育和功能而言无比重要的活动。”
深层挑战
过去5年中，“脑计划”的财政资助加速了这一领域的进步，“也发展出了更好的GEVIs技术。”斯坦福大学的蛋白质工程师迈克尔·林（Michael Lin）表示。
新传感器研发的同时，科学家还在进行对大脑中传播的快速电信号进行精准成像的研究。挑战在于，现如今的技术仅仅对培养皿中的细胞或脑的表面组织有效，但是“哺乳动物的脑并不是透明的，”加州大学伯克利分校的物理学家吉娜比喻道，“它看起来像豆腐。”
随着研究的深入，研究者转向了更有侵入性的方法，譬如去除表面的一些组织或直接向脑中刺入微内窥镜这种微小的光学仪器。另一种非入侵性的替代方法，可以观测1毫米内的不透明组织，称作双光子显微镜。这一技术使用更长波长、更低能量的光，能够深穿入组织。由于双光子显微镜一次只能照射并记录一个点，捕捉图像的速度过慢而跟不上脑中快速的电位变化。但专家们相信技术的进步将很快使人们看清GEVIs产生的信号。吉娜表示：“这绝对可行。”
如果能以各种方法来克服这些挑战，那么无疑电压成像将成为科学家测量脑活动的主流方法。“在一两年内，会有大量运用电压传感器来研究生物现象的论文发表。”斯坦福大学的神经生物学家托马斯·克兰迪宁（ThomasClandinin）指出。有些人认为这一技术甚至会替代电极，成为解决神经元如何处理和整合信息相关问题的关键技术。
值得一提的是，新手研究者们大多相当乐观：波士顿哈佛医学院的博士后研究员霍克巴姆认为，GEVIs终将成为研究细胞中不同部位对阈下信号反应的首选方案。他计划用电压成像研究信号是如何改变神经元间连接的，这是一个学习中的关键步骤。“这种可能性相当振奋人心，”霍克巴姆说，“我当初在显微镜下看到那耀眼的成像时，也曾兴奋地绕着实验室跳起舞来，当然后面的经验告诉我：当实验方法有效的时候，还是少欢呼为妙。”
资料来源Nature
责任编辑 彦隐